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TaqMan MGB探针实时定量PCR检测Vero细胞残余DNA方法的适用性验证及应用: 2014年; 目的对Taq Man MGB探针实时定量PCR检测Vero细胞残余DNA的方法进行适用性验证及应用。方法对Taq Man MGB探针实时定量PCR检测Vero细胞残余DNA的方法进行特异性、灵敏度、精密性、准确性验证,并应用该方法检测3批次脊髓灰质炎病毒浓缩液、纯化液和原液中Vero细胞残余DNA含量,计算Vero细胞残余DNA去除率。结果 Taq Man MGB探针实时定量PCR能够特异性扩增Vero细胞基因组DNA长串连重复序列;DNA浓度在10-1~10-6 ng/μl范围内标准曲线线性良好,相关系数为0.996,扩增效率为93.54%;检测灵敏度为10-6 ng/μl,高于斑点杂交法;检测高（10-2 ng/μl）、中（10-4 ng/μl）、低（10-6 ng/μl）浓度阳性对照DNA模板的试验内变异系数（CV）为0.145%~3.110%,试验间CV为0.624%~2.359%;检测不同浓度阳性对照DNA的回收率在101.5%~109.4%之间,均在定量方法可接受的回收率范围内;在斑点杂交检测灵敏度范围内,同一样品采用Taq Man MGB探针实时定量PCR法与斑点杂交法半定量检测的结果吻合。3批次脊髓灰质炎病毒浓缩液纯化后可有效去除Vero细胞残余DNA,总去除率约为100%。结论 Taq Man探针实时定量PCR法特异性、精密性、准确性良好,灵敏度高,可作为斑点杂交法的替代方法,用于实验室内部的质量控制。; 刘宇王潇潇宋冬梅温智恒鲁卫卫陈蕾李秀玲; 关键词：TAQ 斑点杂交 VERO细胞残余DNA

不同形式脊髓灰质炎病毒颗粒的免疫原性: 2016年; 目的评价不同形式的脊髓灰质炎病毒（poliovirus,PV）颗粒的免疫原性。方法采用蔗糖密度梯度超速离心法分别将经56℃加热1.5 h处理和未经加热的PV进行分离纯化,收集相应组分,进行电镜观察及SDS-PAGE分析,并测定各组分的D抗原及蛋白含量。用不同PV颗粒组分分别免疫大鼠,均经腿部肌肉注射,共接种3次,每次间隔21 d,于免疫前和第1、2次免疫后21 d经眼眶采血,末次免疫后21 d经心脏穿刺采血,分离血清,微量细胞病变（CPE）抑制法检测血清中抗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型PV中和抗体几何平均滴度（GMT）。结果未经加热处理的PV可分离获得EP（蔗糖浓度16%~19%）和FP（蔗糖浓度22%~24.5%）两种病毒颗粒,电镜观察分别为空心颗粒和实心颗粒,EP经SDS-PAGE分析可见VP0、VP1和VP3病毒蛋白条带,FP可见VP1、VP2、VP3和VP4条带;经56℃加热处理的PV可分离获得HP（蔗糖浓度15%~17%）一种病毒颗粒,电镜观察为空心颗粒,SDS-PAGE分析可见VP0、VP1、VP2、VP3病毒蛋白条带。EP、FP免疫大鼠后,均可诱导产生针对PV的中和抗体,但EP诱导产生的中和抗体GMT低于FP;HP不能诱导产生中和抗体。结论未经加热的PV可分离获得EP和FP两种病毒颗粒,均具有免疫原性;经加热处理的PV仅分离获得HP一种病毒颗粒,不具有免疫原性。; 郭会杰宋冬梅吴蕴怡鲁卫卫温智恒田龙张越马淑花张中洋李秀玲; 关键词：脊髓灰质炎病毒病毒颗粒免疫原性

用于肠道病毒71型灭活疫苗纯度分析的毛细管区带电泳法研究被引量：2: 2014年; 目的：建立毛细管区带电泳（capillary zone electrophoresis,CZE）方法,用于肠道病毒71型（Enterovirus 71,EV71）灭活疫苗纯度检测及分析。方法：以样品检测峰高度、分离度、信噪比为判断标准,对不同运行缓冲液、样品缓冲液、毛细管长度、上样时间等进行选择优化,确定毛细管区带电泳条件,同时采用HPLC法分离及免疫共沉淀法对各样品检测峰进行鉴定。利用建立的CZE方法对7批EV71灭活疫苗原液进行检测,采用面积归一法,计算疫苗原液纯度。结果：当运行缓冲液为pH 8.2硼酸缓冲体系、盐浓度为150 mmol·L^-1、SDS浓度为10 mmol·L^-1时,上样时间为100 s、毛细管有效长度为50 cm时,主检测峰高度最高、信噪比最优和分离度大于1.5。以含SDS 10 mmol·L^-1的150 mmol·L^-1pH 8.2硼酸盐缓冲液为运行缓冲液,5 mmol·L^-1硼酸盐缓冲液为上样缓冲液,以长50 cm、内径为50μm的无涂层石英毛细管作为色谱分离柱,对EV71灭活疫苗原液纯度进行检测,可见2个样品检测峰,经HPLC法及免疫共沉淀法鉴定,样品检测峰1为EV71病毒颗粒,迁移时间6.98 min、样品检测峰2为杂质,迁移时间8.42 min;连续进样6次,2个样品检测峰的峰面积、峰起时间、峰止时间和保留时间的相对标准偏差（relative standard deviation,RSD）均〈2.0%。应用该方法对7批EV71灭活疫苗原液纯度进行检测,为95.3%-99.4%,均大于95%。结论：初步建立了可用于EV71灭活疫苗原液纯度测定的毛细管区带电泳方法,为该疫苗的质量研究、工艺过程控制及稳定性研究奠定了基础。; 吴蕴怡郭会杰马淑花陈蕾温智恒鲁卫卫李秀玲; 关键词：肠道病毒71型灭活疫苗毛细管区带电泳纯度测定

肠道病毒71型灭活疫苗的小鼠细胞免疫效果被引量：5: 2014年; 目的评价肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)灭活疫苗诱导小鼠的细胞免疫效果。方法分别以不同剂量(1、2.5、5、10μg/ml,均含铝佐剂1 mg/ml)、不同剂型(含铝佐剂1 mg/ml或不含铝佐剂)、不同免疫剂次(单次免疫或加强免疫)EV71灭活疫苗经腹腔免疫小鼠,0.5 ml/只,均设铝佐剂对照组(仅注射铝佐剂1 mg/ml)。采用经典小鼠树突状细胞(dendritic cell,DC)培养方法制备正常小鼠DC,瑞氏染色法检测细胞形态,流式细胞术分析其表型及纯度;免疫磁珠分选法(magnetic activated cell sorting,MACS)分离小鼠脾脏CD4+、CD8+T淋巴细胞,流式细胞术检测细胞纯度。ELISPOT法检测各组免疫小鼠CD4+、CD8+T淋巴细胞分泌IL-2、IL-4、IFNγ的水平;细胞因子试剂盒检测小鼠淋巴细胞培养上清及小鼠血清中细胞因子的水平。结果 DC形态不规则,表面树枝状突起形态不同,细胞核较大且不规则;DC纯度为(81.39±9.24)%,可高水平表达MHⅡ(I-A/I-E)类分子,中度表达CD86和CD40。CD4+、CD8+T细胞纯度分别为95.27%和94.08%。随着疫苗免疫剂量的增加,CD4+T细胞分泌IL-2、IL-4、IFNγ及CD8+T细胞分泌IFNγ的SFC显著增加,5μg/ml疫苗组达最大值,且明显高于其他组(P均<0.05);5μg/ml疫苗组淋巴细胞培养上清中IFNγ、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-13、IL-5、TNF-α含量明显高于其他组(P<0.05);1、2.5、5μg/ml疫苗组血清中IL-10含量明显高于铝佐剂对照组(P<0.05),1μg/ml疫苗组明显低于2.5及5μg/ml疫苗组(P<0.05)。含铝佐剂疫苗组CD4+T细胞分泌IL-2、IL-4、IFNγ及CD8+T细胞分泌IFNγ的SFC、淋巴细胞培养上清中IL-2、IFNγ、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13、TNF-α水平及血清中IL-10含量均明显高于无铝佐剂疫苗组(P均<0.05)。加强免疫组CD4+T细胞分泌IL-2、IL-4、IFNγ及CD8+T细胞分泌IFNγ的SFC、淋巴细胞培养上清中IL-2、IFNγ、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13、TNF-α水平、血清中IL-10含量均明显高于单次免疫组(P; 鲁卫卫吴蕴怡郝春生宋冬梅马淑花刘宇陈蕾李秀玲; 关键词：肠道病毒71型灭活疫苗细胞免疫

Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗免疫原性研究被引量：2: 2015年; 目的:评价Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗(Sabin strain inactivated poliomyelitis vaccine,s IPV)的免疫原性。方法:将130只大鼠随机分成13组,分别为无佐剂s IPV原倍(Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ型抗原含量为:10 DU/50 DU/30 DU)、3倍、9倍、27倍稀释抗原剂量组、含佐剂s IPV原倍(Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ型抗原含量为:10 DU/50 DU/30 DU)、3倍、9倍、27倍稀释抗原剂量组、野毒株脊髓灰质炎灭活疫苗(Conventional inactivated poliomyelitis vaccine,c IPV)原倍(Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ型抗原含量为:40 DU/8 DU/32 DU)、3倍、9倍、27倍稀释抗原剂量组和阴性对照组。每组10只,腿部肌内注射,0.5 m L·只-1,免疫两剂,免疫间隔时间为21 d。免疫前、第1剂免疫后21 d眼眶采血、第2剂免疫后21 d心脏穿刺采血,分离血清,采用微量细胞病变抑制法测定血清中抗脊髓灰质炎病毒Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ型中和抗体效价,计算无佐剂s IPV和含佐剂s IPV ED50值、并与c IPV进行比较。结果:免疫1剂后,无佐剂s IPV、含佐剂s IPV和c IPV组Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ型在不同稀释度时,除含佐剂s IPVⅠ型均为100%阳转率,其他几组均随着抗原稀释度的增加中和抗体的阳转率梯度下降。Ⅰ型无佐剂、含佐剂s IPV ED50分别是c IPV的0.02,0.004倍;Ⅱ型无佐剂、含佐剂s IPV ED50分别是c IPV的26.83,5.55倍;Ⅲ型无佐剂、含佐剂s IPV分别是c IPV的0.24,0.13倍。Ⅰ型含佐剂s IPV组1剂免疫后各剂量组大鼠血清中和抗体显著高于无佐剂s IPV相应剂量组(P<0.05),免疫两剂后,略高于无佐剂组,但没有统计学差异。Ⅱ型含佐剂s IPV各剂量组1剂免疫后大鼠血清中和抗体略高于无佐剂相应剂量组,但仅16.7 DU组存在统计学差异(P<0.05),免疫两剂后,仅50 DU组明显高于无佐剂组(P<0.05)。Ⅲ型含佐剂s IPV各剂量组1剂免疫后大鼠血清中和抗体略高于无佐剂相应剂量组,但均无统计学差异;免疫两剂后,30 DU组和1.1 DU组明显高于相应剂量组(P<0.05)。结论:s IPV免疫原性较好,其中Ⅰ型免疫�; 宋冬梅张中洋鲁卫卫温智恒郭会杰张越李秀玲; 关键词：中和抗体免疫原性

肠道病毒71型致病机制研究进展: 2013年; 肠道病毒71型（enterovirus 71，EV71）是引起手足口病的主要病原体之一，其感染可导致多种与神经系统相关的疾病，致残率及病死率较高。目前，关于其免疫机制和致病机制尚未完全清楚。此文阐述了机体对EV71的免疫应答以及EV71感染的致病机制的最新研究进展。; 鲁卫卫郭会杰李秀玲; 关键词：肠道病毒免疫细胞因子类致病机制

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鲁卫卫

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