目的原核表达柯萨奇病毒A组16型(Coxsackievirus group A type 16,CA16)VP1蛋白,并检测其免疫原性。方法通过RT-PCR法从CA16病毒青岛株中扩增VP1基因,克隆至原核表达载体pET43.1a(+)中,构建重组表达质粒pET43.1a-VP1,转化感受态E.coli Rossatte(DE3),IPTG诱导表达。表达的重组CA16 VP1蛋白通过Ni柱亲和层析纯化后,采用不同剂量(5、10、20、40μg)免疫BALB/c小鼠,ELISA法检测血清中特异性IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3抗体效价,微量细胞病变抑制法检测血清中和抗体效价。结果重组表达质粒pET43.1a-VP1经双酶切及测序证实构建正确;表达的重组CA16 VP1蛋白相对分子质量约为34 000,主要以包涵体形式存在,表达量占菌体总蛋白的15%;纯化的重组CA16 VP1蛋白纯度可达95%以上,可与猴CA16抗血清反应;不同剂量的重组CA16 VP1蛋白免疫BALB/c小鼠,可诱导产生CA16特异性抗体,血清中总IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3抗体效价均明显高于对照组,且抗体效价与免疫剂量存在一定的量效关系;各剂量CA16 VP1组免疫小鼠血清中和抗体效价均小于1∶8。结论已成功在大肠杆菌中表达了重组CA16 VP1蛋白,纯化的重组蛋白可诱导小鼠特异性体液免疫应答,为进一步研究CA16的结构、功能及相关疫苗的研制奠定了基础。
目的对Taq Man MGB探针实时定量PCR检测Vero细胞残余DNA的方法进行适用性验证及应用。方法对Taq Man MGB探针实时定量PCR检测Vero细胞残余DNA的方法进行特异性、灵敏度、精密性、准确性验证,并应用该方法检测3批次脊髓灰质炎病毒浓缩液、纯化液和原液中Vero细胞残余DNA含量,计算Vero细胞残余DNA去除率。结果 Taq Man MGB探针实时定量PCR能够特异性扩增Vero细胞基因组DNA长串连重复序列;DNA浓度在10-1~10-6 ng/μl范围内标准曲线线性良好,相关系数为0.996,扩增效率为93.54%;检测灵敏度为10-6 ng/μl,高于斑点杂交法;检测高（10-2 ng/μl）、中（10-4 ng/μl）、低（10-6 ng/μl）浓度阳性对照DNA模板的试验内变异系数（CV）为0.145%~3.110%,试验间CV为0.624%~2.359%;检测不同浓度阳性对照DNA的回收率在101.5%~109.4%之间,均在定量方法可接受的回收率范围内;在斑点杂交检测灵敏度范围内,同一样品采用Taq Man MGB探针实时定量PCR法与斑点杂交法半定量检测的结果吻合。3批次脊髓灰质炎病毒浓缩液纯化后可有效去除Vero细胞残余DNA,总去除率约为100%。结论 Taq Man探针实时定量PCR法特异性、精密性、准确性良好,灵敏度高,可作为斑点杂交法的替代方法,用于实验室内部的质量控制。
目的 建立柯萨奇病毒A组16型（Coxsackievirus group A type 16,CA16）抗原定量检测的ELISA方法,用于CA16疫苗中抗原的定量检测。方法 以纯化的CA16病毒颗粒作为免疫原,分别免疫家兔和BALB/c小鼠,制备抗CA16多克隆抗体和单克隆抗体。以抗CA16多抗作为包被抗体,经HRP酶标记的单抗作为酶标抗体,建立CA16抗原定量检测的双抗体夹心ELISA方法,确定该方法的线性范围,并进行准确度、精密度、稳定性及特异性验证。用建立的方法检测CA16疫苗原液制备过程样品中CA16抗原含量。结果 以抗CA16多抗为包被抗体,针对74株不同基因型的CA16的ELISA检测结果均为阳性,该抗CA16单抗的广谱性较好。该方法的线性范围为23.4～750 ng/ml,R2跃0.99,最小检出量为23.4 ng/ml;样品回收率在89%～108%之间,CV约15%,准确度和精密度较好;抗体包被板干燥后于37℃放置6 d,CV约20%,稳定性较好;PV纯化样品、EV71收获液、Vero细胞样品中抗原的A值均小于cutoff值,特异性较好。随着CA16疫苗制备过程的不断进行,中间品1-4比活分别为0.44、0.64、92.13和1 239.03,呈逐渐上升趋势。结论 建立了CA16抗原定量检测的双抗体夹心ELISA方法,该方法准确度、精密度高,稳定性及特异性较好,为CA16疫苗的研制及工艺开发奠定了基础。
