刘萌萌
- 作品数：2 被引量：2H指数：1
- 供职机构：武汉生物制品研究所有限责任公司更多>>
- 发文基金：国家科技重大专项更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生更多>>
- 表达全人源抗人IgE单抗的细胞株构建及筛选被引量：2
- 2015年
- 目的:构建及筛选高效表达原创性全人源抗人Ig E单克隆抗体的重组工程细胞株。方法:将采用核糖体展示技术筛选到的原创性全人源抗人Ig E单链抗体(sc Fv)基因改构设计为Ig G1κ型全长抗体,构建重组真核表达质粒并电转染CHO-S细胞,Dot-blot法选取多株高表达克隆进行40ml摇瓶批次培养,再据细胞生长特征及抗体表达量选取高表达克隆进行40ml摇瓶及3L摇瓶流加培养研究,选取候选细胞株并对改构前后抗体的生物学活性进行比较研究。结果:成功构建了p MH3-H、p MH3-L、p CApuro-H、p CApuro-L四种重组真核表达质粒并成功共转染CHO-S细胞。完成了4次电转染8轮细胞克隆筛选,获得两株表达量较高的候选克隆Mab1#和Mab2#,在3L摇瓶流加培养中抗体表达量分别达到470mg/L及499mg/L。生物膜光干涉技术(Bio-Layer Interferometry,BLI)亲和力结果显示Mab1#及Mab2#两株单抗亲和力均达到nmol/L级(10-9),与现有唯一上市的抗人Ig E单抗药物奥马珠单抗(Omalizumab)的亲和力相当。选取Mab1#全长抗体与其改构前的母本单链抗体的表面等离子共振技术(surface plasmon resonance,SPR)中和活性比较结果显示Mab1#抑制h Ig E与FcεRI结合的EC50为3nmol/L,EC90为9nmol/L,较改造前亲和力提高了4.3倍,中和活性(EC50)提高了23.7倍,中和活性(EC90)提高了41.3倍。结论:成功将表达原创性全人源抗人Ig E的单链抗体(约25k Da)改造为亲和力及中和活性均大幅提升的全长抗体(约150k Da),获得2个候选细胞株。
- 张银川刘萌萌张雅婷桂芳张爱华闭兰潘勇兵
- 关键词：单克隆抗体细胞株
- 表达全人源抗人IgE单抗的候选细胞株鉴定及筛选
- 2015年
- 目的:鉴定及筛选表达原创性全人源抗人Ig E单克隆抗体的候选工程细胞株。方法:对实验室前期筛选到的Mab1#及Mab2#2个候选细胞株的3 L摇瓶流加培养12 d并经Protein A一步柱层析纯化的抗体样品,进行紫外光谱全波长扫描,采用LC-MS测定精确相对分子质量进行鉴别,采用SDS-PAGE(还原型及非还原型)进行分子完整性分析,采用SEC-HPLC进行集聚倾向性分析,采用IEF进行等电点(p I)测定及对N-糖苷酶(PNGase F)酶切前后样品的电荷进行比较分析,采用CEX-HPLC进行电荷异质性分析。同时,对Mab1#及Mab2#2个候选细胞株的3个月传代稳定性进行比较研究。结果:Mab1#及Mab2#2个候选细胞株表达抗体的紫外最大吸收波长均为280 nm;LC-MS轻链相对分子质量分别为23 464.82和23 465.06,重链(G0F糖型)相对分子质量分别为50 807.50 Da和50 807.48 Da,均与理论预期相符;SDS-PAGE(还原型及非还原型)电泳结果显示表达的抗体分子完整性好;SEC-HPLC聚集倾向分析显示2株单抗经一步Protein A亲和柱层析后的可溶性聚合体的含量均小于2%;IEF结果显示Mab1#和Mab2#p I分别为8.38和8.44,PNGase F酶切前后未见明显的由于糖基化修饰引起的电荷变异体。CEX-HPLC结果显示2株单抗的电荷均一性好,酸性变体及碱性变体含量之和均小于4%。完成的3个月细胞株稳定性研究结果显示Mab1#及Mab2#2株克隆均稳定。结论:Mab1#及Mab2#2个候选细胞株具有相似的目标抗体表达量、表达抗体的质量(分子完整性、聚集倾向、电荷异质性、亲和力)、以及细胞稳定性特征和细胞生长代谢特征等质量属性,均符合制定的阶段筛选目标。
- 张银川潘勇兵刘萌萌桂芳张雅婷张爱华闭兰
- 关键词：细胞株
