卢楠
- 作品数：12 被引量：9H指数：2
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- 锌离子依赖金属蛋白酶1(Zmp1)抑制小鼠RAW264.7细胞增殖以及吞噬体-溶酶体的融合被引量：2
- 2016年
- 目的观察卡介苗（BCG）的锌离子依赖金属蛋白酶1（Zmp1）对RAW264.7小鼠巨噬细胞的增殖以及吞噬体-溶酶体融合的影响。方法在大肠杆菌BL21（DE3）中克隆表达Zmp1,用金属螯合磁珠纯化;用纯化的Zmp1处理RAW264.7细胞,采用CCK-8法检测（0、24、48、72、96）h的细胞增殖情况,采用流式细胞术检测细胞周期分布;用减毒沙门菌感染RAW264.7细胞诱导吞噬体形成后,用Zmp1处理细胞,在吞噬体内的减毒沙门菌和溶酶体的溶酶体相关膜蛋白1（LAMP1）分别用相应Alexa Fluor（R）350抗沙门菌抗体（蓝色荧光）和Cy5抗LAMP1抗体（红色荧光）标记,通过荧光显微镜观察RAW264.7细胞内两种荧光,将其重合分析吞噬体与溶酶体融合情况。结果用Zmp1蛋白处理细胞48 h后,细胞增殖活性明显降低;处理48 h后,细胞周期中G1期细胞比例下降,S期比例增高;采用双荧光标记感染沙门菌的RAW264.7细胞,Zmp1处理后显示紫色荧光的吞噬溶酶体融合减少。结论 Zmp1抑制小鼠RAW264.7巨噬细胞增殖,抑制吞噬体-溶酶体融合。
- 方陈城张继明卢楠李鹏樊宇康月茜杨春何永林
- 关键词：细胞增殖溶酶体
- 重庆市耐多药结核分枝杆菌gyrA与rrs基因突变特征分析被引量：1
- 2016年
- 目的分析重庆市耐多药结核分枝杆菌gyrA、rrs基因突变特征及其与氧氟沙星(ofloxacin,Ofx)、卡那霉素耐药(kanamycin,Km)的关系。方法对89株耐多药结核分枝杆菌的Ofx耐药相关基因gyrA和Km耐药相关基因rrs进行序列测定,分析其基因突变特征。结果 89株MDR结核分枝杆菌中有50株对Ofx耐药,其中46株(92.00%,46/50)gyrA基因发生突变,突变位点包括74、89、90、91和94位密码子;22株耐Km菌株中,19株(86.36%,19/22)发生rrs基因突变,突变类型均为A1401G。Ofx、Km耐药株的gyrA、rrs基因突变率明显高于相应敏感株的基因突变率,两者之间的差异有统计学意义(χ2=62.937,P<0.001;Fisher双侧P<0.001)。结论 gyrA基因90、91、94位密码子突变是重庆市耐多药结核分枝杆菌Ofx耐药的主要机制;rrs基因A1401G突变则是Km耐药的主要原因。
- 胡彦杨春逄宇卢楠刘洁沈静朱大冕冯鑫
- 关键词：分枝杆菌结核耐多药GYRA基因
- 利用CRISPR/Cas9系统检测同源片段长度对重组效率的影响
- 2018年
- 目的:在大肠埃希菌中利用CRISPR/Cas9系统对插入失活的m Cherry红色荧光报告基因进行靶向切割并重组,以研究同源片段长度对重组修复效率的影响。方法:通过Golden Gate克隆方法构建Cas9表达质粒p KD46-Cas,转化至大肠埃希菌DH5α中,阿拉伯糖诱导表达Cas9蛋白,Western blot检测蛋白表达。用同样的方法,将一段随机靶标序列引入p Tac-m Cherry-3guid质粒中,造成插入失活,同时在插入序列两侧分别预留0、40、80、120 bp的m Cherry编码区overlap序列,构建出含不同长度同源片段的插入失活m Cherry荧光报告质粒p Q0、p Q40、p Q80、p Q120,并将其分别转化到表达Cas9蛋白的大肠埃希菌DH5α中,对应的细菌平板分别为p Q0组、p Q40组、p Q80组及p Q120组,每组各9个平板,对每个平板的红、白色菌落进行计数,分别计算出红色菌落数/菌落总数的比值,即为重组修复效率。结果:PCR及测序证实p KD46-Cas质粒及插入失活的m Cherry荧光报告载体p Q0、p Q40、p Q80、p Q120构建成功,Western blot鉴定p KD46-Cas在大肠埃希菌DH5α中表达Cas9蛋白;红色菌落计数显示p Q0组为0,其余3组均出现红色菌落,4组重组修复效率的差异有统计学意义(P<0.05),重组修复效率与同源片段长度呈正相关(r=0.792,P<0.01)。结论:成功建立了基于m Cherry红色荧光报告基因和Cas9的同源重组效率检测系统;研究表明不包含同源片段的质粒无法进行有效的重组,当同源片段在0~120 bp时其长度对重组效率有影响。此系统为深入研究原核生物的同源重组提供了一个新的技术平台。
- 孙菱康月茜唐弘卢楠徐蕾杨婕庄稀尧王瑜伟杨春
- 携带Lipocalin 2基因重组减毒沙门菌的构建及其对分枝杆菌生长影响的研究被引量：1
- 2020年
- 目的:探讨携带脂质运载蛋白2(lipocalin 2,Lcn2)的减毒沙门菌对分枝杆菌生长的影响。方法:以巨噬细胞RAW264.7提取RNA逆转录为c DNA为模版,采用PCR法扩增Lcn2基因,定向克隆到质粒pBudCE4.1-orim的多克隆位点中,构建重组质粒pBudCE4.1-orim-Lcn2;将重组质粒转染RAW264.7细胞,用RT-qPCR法检测Lcn2的mRNA相对表达量,并以空白载体为对照组;将重组质粒转入减毒沙门菌SL7207得到重组菌株SL7207-pBudCE4.1-orim-Lcn2;重组菌感染RAW264.7细胞,Western blot检测Lcn2的蛋白表达,RT-qPCR法检测Lcn2的mRNA的相对表达量,并以空载菌组为对照;7H10平板上通过菌落计数观察重组菌对感染RAW264.7细胞的卡介苗(Bacille calmette-guerin,BCG)生存的影响,以空载菌组为对照。用重组菌灌胃小鼠,检测脾组织Lcn2和血清IFN-γ水平,以空载菌和生理盐水为对照组。结果:PCR扩增出Lcn2基因;重组质粒经双酶切及基因测序鉴定正确。重组菌感染RAW264.7细胞Lcn2的蛋白表达量较对照组增加(P=0.000)。RT-qPCR法检测重组菌、重组质粒Lcn2 mRNA表达较对照组明显升高(P=0.000,F=5.281;P=0.000,F=22570)。7H10平板上重组菌组BCG数量与空载菌组相比明显减少(P=0.000,F=11.41)。重组菌组与空载对照菌组相比小鼠脾组织Lcn2表达升高(P=0.000,F=4.449),重组菌组与生理盐水组血清IFN-γ升高(P=0.004,F=15.27)。结论:成功构建了携带Lcn2基因的重组减毒沙门菌。重组菌感染RAW264.7细胞后Lcn2的表达增加,对感染RAW264.7的BCG存活起到一定的抑制作用。重组菌灌胃后小鼠脾组织Lcn2表达增加,血清IFN-γ含量增加,小鼠免疫状态有利于结核病转归。该研究为进一步研究脂质运载蛋白和结核分枝杆菌感染的关系及分子机制打下基础。
- 唐弘王瑜伟何永林卢楠徐蕾庄稀尧李智颖杨婕陈俊伊熊雨涵杨春
- 关键词：减毒沙门菌分枝杆菌RAW264.7细胞
- 新型基因组编辑蛋白FnCpf1的表达、鉴定及多克隆抗体的制备被引量：2
- 2017年
- 目的:构建土拉弗朗西丝菌Novicida亚种Cpf1蛋白编码基因的原核表达质粒,在大肠杆菌中表达、纯化重组Fn Cpf1蛋白后,制备兔抗Fn Cpf1多克隆抗体。方法:利用PCR技术扩增Fn Cpf1基因,将其克隆到原核表达载体pET-32a(+)中并转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导目的蛋白的表达,通过镍离子金属螯合磁珠亲和纯化得到纯度较高的Fn Cpf1蛋白,将纯化蛋白免疫新西兰大白兔制备Fn Cpf1多克隆抗体,并用间接ELISA法检测兔抗血清效价、Western blot鉴定其特异性。结果:扩增得到3 900 bp的目的基因片段,克隆到表达载体pET-32a(+)后,通过双酶切及测序证实pET-32a(+)-Fn Cpf1表达载体构建成功,可诱导表达相对分子质量160 k D的目的蛋白,经SDS-PAGE分析其为可溶性,通过镍离子金属螯合磁珠亲和纯化得到纯度为95%以上的Fn Cpf1蛋白,制备多克隆抗体并检测兔抗Fn Cpf1抗血清ELISA效价达1:512 000,Western blot结果显示制备的抗体可较好地与Fn Cpf1蛋白特异性结合。结论:在原核系统中成功表达了Fn Cpf1重组蛋白,并用纯化后的蛋白制备出兔抗Fn Cpf1抗体,效价及特异性均良好,为进一步探讨Cpf1蛋白的生物学特性打下实验基础。
- 孙菱卢楠杨春康月茜杨婕何永林方陈城吴宣艳王瑜伟
- 关键词：多克隆抗体
- 一种用于替代高致病性志贺菌的大肠埃希菌菌株的制备方法及其应用
- 本发明公开了一种用于替代高致病性志贺菌的大肠埃希菌菌株的制备方法及其应用，该方法采用CRISPR/Cas9技术对E.coli DH5α基因组进行改造，成功敲除了其tnaA和FliC基因。随后，构建了一种表达福氏志贺菌菌体...
- 卢楠张光媛刘佳陆其聪
- 结核分枝杆菌Rv2460c基因的克隆,表达及编码产物的免疫特性分析被引量：1
- 2015年
- 目的:对结核分枝杆菌Rv2460c基因(编码Clp P2蛋白)进行克隆,表达,并评价其编码产物的免疫原性。方法:扩增结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)H37Rv的Rv2460c基因,构建重组质粒p ET32a(+)-Clp P2,用IPTG诱导表达,利用亲和层析法进行纯化。用SDS-PAGE和Western blot分析重组蛋白Clp P2的表达和鉴定。用生物信息学对Mtb Clp P2的免疫原性分析和表位预测。酶联免疫吸附法(ELISA)测定兔和TB病人血清anti-Clp P2滴度。结果:重组Clp P2蛋白酶在大肠杆菌中以包涵体形式表达,经bandscan软件分析纯化蛋白的纯度为93%。生物信息学分析Mtb Clp P2蛋白具有多个优势B细胞表位和T细胞表位。ELISA法测定兔抗血清效价为1∶64 000;检测肺结核病人血清中anti-Clp P2抗体水平高于健康对照人群。结论:成功纯化了重组蛋白Clp P2和制备了特异性兔抗Clp P2多克隆抗体,实验和信息学均表明Mtb Clp P2蛋白酶有较强的免疫原性。
- 康月茜张春燕穆柳青卢楠杨春李岱容
- 关键词：结核分枝杆菌免疫原性
- EV71病毒反向遗传学系统的建立及拯救病毒的鉴定
- 2019年
- 目的:建立高效的EV71病毒反向遗传学系统,快速获得拯救病毒并鉴定其活性。方法:首先构建含有人RNA聚合酶Ⅰ启动子(PpolⅠ)、ccdB自杀基因和鼠终止子(mTer)的接收质粒pHM-ccdB,并在ccdB两侧引入AarⅠ酶切位点;为了回避EV71病毒基因组中自身的AarⅠ酶切位点,分两段PCR扩增基因组,在引物中引入必需的AarⅠ酶切位点,通过Golden Gate Clone技术连接到目的载体中获得病毒拯救质粒pHT-EV71,转染至RD细胞后,获得拯救的EV71病毒,并以RT-PCR、病毒滴度、Western blot以及电镜检测等方法鉴定拯救子代病毒。结果:通过引入ccdB致死基因和Golden Gate Clone成功构建了EV71病毒的拯救质粒(pHT-EV71),并将其转染至RD细胞后,观察到明显的致细胞病变效应(cytopathic effect,CPE),将得到的拯救子代病毒,经EV71 VP1的特异性引物进行RT-PCR扩增,观察到长约1900 bp的特异性条带;Western blot结果显示,该病毒可与EV71 VP1特异抗体结合;透射电子显微镜(transmission electron microscopy,TEM)检测可见20~30 nm球形病毒颗粒;在RD细胞中将子代病毒连续增殖8代后,检测其毒力高于母本株(6.35 lgTCID50/mL)。结论:通过引入ccdB和Golden Gate Clone技术,建立了快速、高效构建EV71病毒的拯救质粒的方法,效率达到100%,为正链RNA病毒反向遗传学系统的构建提供了一种新的策略,为进一步研究EV71病毒的致病机制及疫苗制备等提供了技术平台。
- 庄稀尧卢楠唐弘李智颖陈俊伊熊雨涵徐蕾王瑜伟康月茜杨春
- 关键词：肠道病毒71病毒拯救病毒滴度
- microRNA与结核病相互关系的研究进展被引量：2
- 2015年
- microRNA(miRNA)是一类广泛存在于各种生物体内的小分子非编码单链RNA,主要在转录后水平调控靶基因的表达。越来越多的证据表明它在细胞分化与沟通、机体发育、免疫反应等诸多方面都发挥着重要作用。尤其在疾病相关研究中,miRNA更是具有广泛的用途和美好的前景。本文主要针对miRNA的相关特性、与结核病(tuberculosis,TB)相互关系的研究进展以及应用前景等做综述。
- 樊宇杨春何永林徐蕾卢楠穆柳青张春燕康月茜
- 关键词：MICRORNA结核病结核分枝杆菌BACILLUS
- RseA基因影响耻垢分枝杆菌药物敏感性的生物信息学分析与初步验证
- 2021年
- 目的筛选RseA在耻垢分枝杆菌中可能调控药物敏感性的基因或通路,并进行初步验证。方法利用分子克隆技术构建RseA基因过表达耻垢分枝杆菌组和空质粒对照组;利用转录组测序技术和生物信息学方法筛选2组细菌间的差异表达基因(DEGs),分析其基因本体论(GO)及京都基因和基因组百科全书(KEGG)富集情况;并构建蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络。利用结核分枝杆菌复苏促进因子E(RpfE)促使非复制持留菌复苏,测定复苏指数(RI)对筛选出的关键靶向基因或通路进行初步验证。结果RseA基因过表达后,筛选出2403个DEGs,其中2335个表达上调,68个表达下调。GO分析结果表明,DEGs主要参与氮化合物代谢过程的调控、RNA代谢过程的调控、转录因子活性和序列特异性DNA结合过程调控等。KEGG分析结果显示,DEGs主要参与萜类骨架的生物合成、果糖和甘露糖代谢和同源重组等通路。从PPI网络MCODE模块中筛选出前8个hub基因rpsG、rplM、rpsO、rpsT、rpmH、rplS、rpsJ、rplT,并从这些基因的分析结果得知,其主要参与了核糖体通路。使用RpfE促进复苏后,RseA组复苏指数明显低于对照组。结论RseA调控了多个靶向基因,参与核糖体的结构组成和核糖体通路,增强耻垢分枝杆菌对抗结核药物的敏感性,为进一步的机制研究奠定了基础。
- 熊雨菡李智颖卢楠陈俊伊唐佳玲徐蕾杨春何永林
- 关键词：转录组测序耻垢分枝杆菌生物信息学药物敏感性
