李青
- 作品数：4 被引量：4H指数：2
- 供职机构：复旦大学生命科学学院微生物学与微生物工程系更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国际科技合作与交流专项项目更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 慢病毒介导的绿色荧光蛋白基因在日本血吸虫体内的表达和检测被引量：2
- 2016年
- 目的验证外源绿色荧光蛋白基因在日本血吸虫(Schistosoma japonicum)体内能否成功表达并产生绿色荧光。方法采用荧光显微镜观察日本血吸虫不同虫期虫体的背景荧光情况。利用含有由巨细胞病毒(CMV)启动子驱动的绿色荧光蛋白zs Green基因的慢病毒载体感染体外培养的14 d童虫,未感染对照组采用不含慢病毒的RPMI 1640培养液(含10%胎牛血清)培养。感染后48 h,提取童虫基因组DNA和总RNA,合成c DNA,PCR检测zs Green基因是否整合入基因组以及绿色荧光蛋白m RNA的转录表达情况。在感染后24和48 h,以及换为不含慢病毒的RPMI 1640培养液后的不同时间点,使用荧光显微镜观察被感染童虫发出的绿色荧光,并判断其是否为绿色荧光蛋白基因在虫体内表达而产生的绿色荧光信号。结果荧光显微镜观察可见,日本血吸虫童虫无明显自发荧光现象,成虫可自发明显荧光。感染组童虫基因组DNA和总c DNA PCR检测结果显示,均扩增出大小为173 bp的阳性条带,与zs Green基因片段一致,且测序结果正确。荧光显微镜观察可见,而感染组童虫在感染后24 h,肠道内出现绿色荧光亮点,但疑似食物残渣。感染后48 h,童虫肠道发出均匀的绿色荧光,其亮度高于慢病毒培养液的背景荧光亮度。更换为不含慢病毒的RPMI 1640培养液3 d后,童虫肠道内绿色荧光变弱,一周后绿色荧光消失。重新更换为含慢病毒的RPMI 1640培养液感染童虫,2 d后在肠道内再次发现均匀绿色荧光。未感染对照组童虫未出现绿色荧光。结论外源绿色荧光蛋白可在日本血吸虫体内表达,但荧光显微镜下观察到的绿色荧光信号还有待进一步确认。
- 辛玥赵楠李青胡薇
- 关键词：日本血吸虫绿色荧光蛋白慢病毒载体
- 慢病毒介导的绿色荧光蛋白基因在日本血吸虫体内的成功表达
- 2017年
- 目的了解日本血吸虫(Schistosoma japonicum)体内能否表达外源绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP),并产生绿色荧光。方法构建p EGFP-Lac Z-C1融合蛋白表达质粒,以聚乙烯亚胺(polyethylenimine,PEI)为转染试剂,分别转染哺乳动物293T细胞和感染小鼠后14 d的日本血吸虫童虫,未转染阴性对照组不做任何处理;转染后48 h,在荧光显微镜下观察被转染的293T细胞和日本血吸虫童虫是否有GFP绿色荧光产生;对被转染的293T细胞和日本血吸虫童虫进行β-半乳糖苷酶原位染色,在光学显微镜下观察是否有蓝色产物产生。同时,将日本血吸虫童虫放入培养293T细胞的12孔板中,分别在光学显微镜和荧光显微镜下观察。用未稀释的、滴度为3×10~8菌落形成单位(CFU)/ml的慢病毒体外感染日本血吸虫童虫和293T细胞96 h后,在荧光显微镜下观察是否有GFP绿色荧光产生。结果p EGFP-Lac Z-C1转染293T细胞后,可以观察到GFP绿色荧光,β-半乳糖苷酶原位染色后也可以观察到蓝色的斑点,而在对照组和日本血吸虫童虫中,均未观察到GFP荧光和蓝色斑点。日本血吸虫童虫和293T细胞GFP荧光的比较发现,293T细胞发出的GFP荧光亮度明显高于日本血吸虫童虫的自发荧光,且293T细胞GFP荧光为艳绿色,而日本血吸虫童虫的自发荧光为黄绿色。在慢病毒感染实验中,未稀释的慢病毒感染96 h后,在荧光显微镜下可以清晰地看到血吸虫肠道外围组织中有许多艳绿色的荧光亮点,日本血吸虫童虫GFP的颜色及亮度与293T细胞中的基本一致,且荧光亮点的移动与虫体的肌肉运动基本保持一致。结论日本血吸虫童虫的背景荧光在外源GFP表达充足的情况下并不会影响荧光的观察。未稀释的慢病毒感染日本血吸虫童虫96 h后可提高转染效率,增加GFP表达量,在体内观察到GFP的绿色荧光。
- 赵楠李青胡薇
- 关键词：日本血吸虫绿色荧光蛋白慢病毒载体
- 日本血吸虫胰凝乳蛋白酶样蛋白基因功能的初步研究被引量：2
- 2015年
- 目的探索日本血吸虫胰凝乳蛋白酶样蛋白(chymotrypsin-like protease)在终宿主体内的基因表达、定位和潜在功能,评估该蛋白在小鼠抗血吸虫感染中的免疫保护力。方法利用软件分析日本血吸虫胰凝乳蛋白酶样蛋白(Sj CTRL)基因(Gen Bank登录号为FN317561.1)的理化特性,及与其他物种同源基因的种系发生关系。采用整体原位杂交法定位Sj CTRL基因转录本在d26成虫中的表达部位。利用实时定量荧光PCR方法监测感染后14、18、22和26 d等4个发育时期雌雄虫的Sj CTRL基因转录水平。制备Sj CTRL-ds RNA,采用体外浸泡法对d26合抱雌雄虫进行RNA干扰,并利用共聚焦显微镜观察被干扰虫体的形态学变化。设计特异性引物扩增去除跨膜结构的编码基因序列,并克隆至p ET-28a原核表达载体,转化大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3)后进行原核表达。将纯化重组蛋白免疫C57BL/6小鼠,用尾蚴(40±2条/鼠)攻击感染进行动物保护性实验。同时设对照组。感染后35 d收集虫体和肝脏,统计减虫率、每克肝组织减卵率。结果原位杂交定位结果显示,该基因转录本位于雌虫后段肠道。Sj CTRL基因仅在d26雌虫体内有较高的转录本丰度。Sj CTRL-ds RNA干扰后雌虫相应基因转录本的相对表达量降至25.7%(P<0.05),但未有可观察到的形态学变化。构建了p ET-28a/Sj CTRL重组质粒,诱导表达获得不可溶重组蛋白。免疫保护试验结果显示,减虫率为25.4%,减卵率为80.5%。结论初步探明日本血吸虫胰凝乳蛋白酶样蛋白基因仅在d26雌虫的后段肠道高转录,体外干扰可降低Sj CTRL基因的转录本水平,该蛋白可一定程度上减少感染日本血吸虫的C57BL/6小鼠的成虫数和肝脏虫卵数。
- 柴日奕王吉鹏李健张瑞祥李青刘牧辛玥徐斌胡薇
- 关键词：日本血吸虫原位杂交免疫保护
- 血吸虫转录因子研究现状
- 2016年
- 血吸虫病是一种危害严重的全球性人兽共患寄生虫病。新药和疫苗开发是血吸虫病防治工作中的一项重要环节。了解血吸虫转录调控机制及转录因子具体功能将有助于理解血吸虫生长发育的分子机制,为筛选新药和疫苗作用靶点提供参考。本文主要就血吸虫转录因子研究现状及研究方法进行综述。
- 辛玥刘牧李青胡薇
- 关键词：血吸虫转录因子转录调控
