蒋敏敏
- 作品数：2 被引量：0H指数：0
- 供职机构：中山大学孙逸仙纪念医院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 构建以eGFP为报告基因的毕赤酵母表达载体
- 2016年
- 目的:构建以绿色荧光蛋白eGFP为报告基因的毕赤酵母表达载体,为后续致病真菌功能基因的eGFP融合基因过表达作铺垫。方法:利用In-Fusion系统构建eGFP的表达载体PPICZαB-eGFP,氯化锂转化毕赤酵母X33,通过含Zeocin(100μg/mL)抗性的YPD培养基筛选,将得到的菌落X33-eGFP以引物3'-AOX/5'-AOX及eGFP-F/eGFP-R进行PCR,产物行琼脂糖凝胶电泳、测序验证eGFP片段是否成功插入,最后甲醛诱导表达。结果:以X33-eGFP为模板的PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果显示片段eGFP成功插入至载体中,测序验证无突变。经甲醛诱导后的毕赤酵母X33-eGFP在蓝色荧光激发下,可观察到发出绿色荧光。结论:成功建立了毕赤酵母X33-eGFP,且证明了eGFP片段可以在毕赤酵母AOX启动子中得到表达。
- 陈志文冯姣蒋敏敏陈春梅肖星何娅易修文陈庭金席丽艳
- 关键词：绿色荧光蛋白毕赤酵母克隆
- 原生质体介导马尔尼菲青霉基因转化体系的优化
- 2016年
- 目的 优化原生质体介导的马尔尼菲青霉转化体系,为其基因功能研究提供良好的平台。方法 通过原生质体介导将构巢曲霉（Aspergillus nidulans）pyrG基因插入马尔尼菲青霉尿嘧啶缺陷株ligD（pyrG-,ligD-）中,在不含尿嘧啶的培养基中筛选阳性转化子,运用PCR验证重组子,通过改变影响转化效率的酶解时间、培养基浓度、质粒浓度、不同配方的原生质体洗涤液STC和不同配方的原生质体助融剂PTC 5个条件对体系进行优化。结果 PCR验证A.nidulans pyrG基因成功的插入ligD中,转化子可稳定传代。最适合ligD原生质体转化效率的条件为：酶解时间6h,PTC（60%PEG-4000,100mmol/L Tris-HCl pH8.0,100mmol/L CaCl2）,每100μL原生质体（106-107/mL）加入2.5μg质粒,0.6 mol/L蔗糖SD/SDU筛选/再生培养基,每1μg质粒转化子可达68个左右。结论 成功优化了原生质体介导马尔尼菲青霉转化体系的条件,优化后该方法转化效率高,为基因功能研究提供良好平台。
- 陈春梅冯姣陈志文肖星蒋敏敏史茗岚贺莉雅蔡文莹席丽艳李希清
- 关键词：马尔尼菲青霉原生质体
