李闯
- 作品数：10 被引量：7H指数：2
- 供职机构：江南大学生物工程学院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金中国博士后科学基金江苏省普通高校研究生科研创新计划项目更多>>
- 相关领域：生物学轻工技术与工程化学工程农业科学更多>>
- 定点突变改善PvEH1对邻甲基苯基缩水甘油醚的催化特性
- 2019年
- 环氧化物水解酶能够对外消旋环氧化物进行动力学拆分保留单构型的环氧化物。测定了菜豆环氧化物水解酶(PvEH1)针对苯基缩水甘油醚及其甲基衍生物的催化特性,并基于分子对接及多序列比对分析确定7个突变位点,通过单点和组合突变对PvEH1进行改造,以期改善PvEH1对邻甲基苯基缩水甘油醚(1a)的催化特性。底物谱分析表明PvEH1对1a的催化活性(157.2U/g湿细胞)和对映选择性(E=5.6)最高。单点突变结果显示E.coli/pveh1 L105I和E.coli/pveh1^V106I对1a的催化活性和对映选择性均有明显提高;L105I和V106I位组合突变菌株E.coli/pveh1^L105I/V106I的催化活性(493.8U/g湿细胞)是E.coli/pveh1的3.1倍,对映选择性(E=8.3)也提高至E.coli/pveh1的1.5倍。纯化后PvEH1 L105I/V106I的催化活性为17.6U/mg,是PvEH1的1.5倍,对1a的催化效率提高至PvEH1的2.1倍。SDS-PAGE分析表明提高了蛋白质的可溶性表达量。利用E.coli/pveh1^L105I/V106I全细胞催化100mmol/L 1a水解动力学拆分获得手性纯(R)-1a (ee>96%)的产率和时空产率分别为31.2%和5.12g/(L·h),因此,在手性纯(R)-1a的制备中,E.coli/pveh1^L105I/V106I是一种颇具潜力的生物催化剂。
- 阚婷婷宗迅成苏永君王婷婷李闯胡蝶邬敏辰
- 关键词：定点突变催化活性动力学拆分
- 干酪乳杆菌L-乳酸脱氢酶突变体在毕赤酵母中的表达及其不对称还原苯丙酮酸
- 2020年
- 为提高L-苯乳酸(L-phenyllactic acid,L-PLA)的生产效率,以干酪乳杆菌Lactobacillus casei L-乳酸脱氢酶突变体L-LcLDH1^Q88A/I229A为研究对象,实现其在毕赤酵母Pichia pastoris GS115中的分泌表达,并与葡萄糖脱氢酶SyGDH偶联,构建并优化体外辅酶循环体系,不对称还原苯丙酮酸(Phenylpyruvate,PPA)制备L-PLA。结果显示,毕赤酵母重组酶reLcLDH1^Q88A/I229A的表观分子量为36.8 kDa,比活力为270.5 U/mg,是原酶的42.9倍。在40℃,初始pH为5.0,底物PPA、辅酶NAD+和葡萄糖浓度分别为100、2和120 mmol/L,SyGDH和reLcLDH1^Q88A/I229A添加量分别为1和10 U/mL的最优条件下,L-PLA的产率可达99.8%,对映体过量(ee)值>99.9%,时空产率和平均转化率分别高达9.5 g/(L·h)和257.0 g/(g·h)。结果表明,reLcLDH1^Q88A/I229A在不对称还原PPA制备L-PLA中生产效率高,具有工业应用的潜力。
- 张婷李剑芳胡蝶李闯胡博淳邬敏辰
- 关键词：乳酸脱氢酶毕赤酵母葡萄糖脱氢酶
- 菜豆环氧化物水解酶的表达及其催化特性研究被引量：4
- 2018年
- 【背景】光学纯环氧化物及邻二醇是一类多功能手性砌块。与化学合成法相比,环氧化物水解酶(EHs)介导的生物转化法因环境友好而成为当前的研究热点。【目的】从菜豆(Phaseolus vulgaris)中克隆一种EH基因并进行原核表达,研究重组酶催化环氧苯乙烷(Styrene oxide,SO)的水解特性。【方法】通过计算机辅助分析EHs的一级结构,推测一种菜豆来源的未知功能蛋白(PvEH4)可能具有EH活性。利用RT-PCR技术,以菜豆总RNA为模板,扩增编码PvEH4的基因pveh4,并实现其在Escherichia coli BL21(DE3)中的表达。利用重组菌E.coli/pveh4全细胞催化SO水解,分析PvEH4的对映选择性和区域选择性。【结果】一级结构分析表明,PvEH4具有α/β折叠型EH特有的保守区域。SDS-PAGE结果显示PvEH4的表观分子量为39.4 kD。PvEH4针对SO的对映选择率(E值)为10.1,区域选择性系数αS和βR分别为99.5%和82.5%。当外消旋SO转化率达到68.1%时,可同时获得99.9%ees的(R)-SO和92.3%eep的(R)-苯乙二醇(Phenyl-1,2-ethanediol,PED),两者的产率分别为31.9%和65.6%。【结论】PvEH4的挖掘不仅增加了植物类EHs的数量,同时也为EHs的蛋白分子改造提供参考。
- 石小玲阚婷婷李闯宗迅成邬敏辰
- 关键词：菜豆对映选择性不对称水解
- 盖子环替换及定点突变提高菜豆环氧化物水解酶对邻甲基苯基缩水甘油醚的催化性能
- 2020年
- 菜豆环氧化物水解酶1和2(PvEH1、PvEH2)能够动力学拆分外消旋邻甲基苯基缩水甘油醚(rac-oMGE),从而保留(R)-oMGE。基于对PvEH1和PvEH2结构的同源模拟和分析,发现二者分子中的盖子环差异较大,故本文选择盖子环作为研究目标。经融合聚合酶链式反应(FPCR),获得了PvEH2的盖子环区域被PvEH1对应区域替换的杂合酶Pv2Pv1。用全细胞酶E.coli/pv2pv1催化rac-oMGE,当(S)-oMGE刚好水解完全时,产物(S)-3-邻甲苯基-1,2-丙二醇((S)-oTPD)的eep由PvEH2的58.3%提高至75.5%。为进一步提高酶的性质,在Pv2Pv1中选取11个氨基酸位点进行丙氨酸(A)突变,获得最优突变子E.coli/pv2pv1K176A,活性为E.coli/pv2pv1(4.2U/g)的2.1倍,且当S构型的底物刚好完全水解时,(S)-oTPD的eep进一步提高为80.3%。分子对接分析发现,盖子环替换和K176位点突变为A,均使(R)-oMGE环氧环中的Cα更易受到酶中D101位点的攻击。利用E.coli/pv2pv1K176A催化150mmol/L rac-oMGE水解制备(R)-oMGE(ees>99%)和(S)-oTPD(eep=80.4%),二者的产率YS和YP分别为32.7%和60.1%,时空产率STYS和STYP为1.6g/(L·h)和3.3g/(L·h)。本实验为改善EH的催化性质提供了一种有效策略。
- 章晨朱秀秀李闯邬敏辰
- 关键词：分子对接
- 菜豆环氧水解酶归一性水解间硝基环氧苯乙烷的研究
- 2020年
- 旨在研究菜豆环氧水解酶PvEH2对映归一性水解外消旋(rac-)间硝基环氧苯乙烷(mNSO)的特性,为制备光学纯(R)-间硝基苯乙二醇(mNPED)提供优良的生物催化剂。构建表达有重组PvEH2的工程菌E.coli/pveh2。以rac-mNSO为底物,借助手性色谱法分析E.coli/pveh2全细胞的EH活性和区域选择性。基于有机助溶剂种类和剂量对酶活性的影响,筛选并优化缓冲液/助溶剂反应体系。结果显示,在菜豆植株中,PvEH2基因的转录水平可能受体外环境诱导因素的影响。E.coli/pveh2的EH活性为15.4 U/g,水解反应的区域选择性系数αS和βR分别为90.3%和96.4%。在经过筛选优化的含有5%(V/V)丙三醇的磷酸干细胞盐缓冲液中,最高底物浓度为40 mmol/L,是原缓冲液体系的4倍。当反应至12 h时,所得(R)-mNPED的光学纯度eep及产率分别为84.9%和90.2%。E.coli/pveh2或PvEH2在水解rac-mNSO中表现出优秀的区域选择性,在制备光学纯(R)-mNPED中具有较好的应用潜力。
- 李闯文正刘畅邬敏辰
- 关键词：环氧水解酶
- 定点突变提高环氧化物水解酶AuEH2催化对甲基苯基缩水甘油醚的对映选择性
- 2020年
- 环氧化物水解酶可催化外消旋环氧化物的动力学拆分或对映归一性水解制备手性环氧化物或邻二醇,具有广阔的应用前景。为提高宇佐美曲霉环氧化物水解酶(Au EH2)催化外消旋对甲基苯基缩水甘油醚(rac-pMPGE)的对映体选择率(E)。通过分子动力学模拟(MD)选取相互作用频率最高的位点A250替换为其他19种氨基酸;选取对映选择性显著提高的突变体测定其动力学参数(Km和kcat)及区域选择性系数(βS和βR),并利用重组大肠杆菌全细胞拆分racp MPGE。突变体AuEH2A250H的E值从12.7提高至38.4,重组菌比活力为51.9U/g湿细胞;其水解(S)-pMPGE的kcat/Km从10.0mmol/(L·s)提高至12.8 mmol/(L·s),而水解(R)-pMPGE的kcat/Km从1.13mmol/(L·s)降低至0.35mmol/(L·s);全细胞拆分20mmol/L rac-p MPGE获得(R)-pMPGE的ees为>99%,产率从33.0%提高至40.7%。A250位点的突变对Au EH2的对映选择性和酶活力具有显著影响;高对映选择性的Au EH2突变体在制备高光学纯的(R)-pMPGE中具有应用潜力。
- 苏永君胡蝶胡博淳李闯文正章晨邬敏辰
- 关键词：定点突变对映选择性
- 木聚糖酶EvXyn11^(TS)N端区域对其耐热性贡献的生物信息学分析
- 2019年
- 系统分析了11家族木聚糖酶EvXyn11^(TS)N端区域对其耐热性的影响。在GenBank数据库中借助BLAST服务器搜寻与EvXyn11^(TS)序列同源性大于55%且温度特性已知的30种木聚糖酶;运用ClustalW2程序和MEGA 5.1软件对31种木聚糖酶进行了多序列比对及进化树构建,从中选择了包含EvXyn11^(TS)在内的8种代表性耐热和中温酶;采用生物学程序软件分析了所选酶在N端的异同点。分析结果表明,EvXyn11^(TS)N端的耐热有利氨基酸含量、β-折叠股A1和氨基酸相互作用等对其耐热性有一定的贡献。
- 臧嘉李闯王瑞吴芹邬敏辰
- 关键词：木聚糖酶耐热性
- 引入盐桥改善木聚糖酶AoXyn11A的温度特性被引量：1
- 2016年
- 为改善米曲霉(Aspergillus oryzae CICC40186)木聚糖酶Ao Xyn11A的温度特性,基于其与同一糖苷水解酶家族耐热木聚糖酶Ev Xyn11TS一级和三维结构的比对和分析,在Ao Xyn11A N端空间区域引入3对盐桥。采用大引物PCR技术对野生型木聚糖酶基因(Aoxyn11A)实施定点突变,构建突变酶Ao Xyn11AS基因(Aoxyn11AS)。分别将Aoxyn11A和Aoxyn11AS在毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中进行表达。酶学性质分析显示:Ao Xyn11AS的最适温度(Topt)为58℃,较Ao Xyn11A提高了8℃;突变酶在50℃的半衰期(t501/2)为60 min,较原酶延长了1倍多,其在55和60℃完全丧失酶活性的时间分别由原酶的15和4 min延长至35和15 min;而突变酶的p H特性和动力学常数较原酶改变不大。在Ao Xyn11A N端空间区域引入盐桥增加了其三维结构的刚性,从而明显改善了其温度特性。
- 吴芹臧嘉李闯王瑞邬敏辰
- 关键词：木聚糖酶温度特性定点突变
- 吐温/缓冲液体系中酶法合成(R)-对氯环氧苯乙烷
- 2020年
- 利用环氧化物水解酶突变体Pv EH1Z4X4-59制备了(R)-对氯环氧苯乙烷〔(R)-p CSO〕。以E.coli/pveh1Z4X4-59全细胞作为生物催化剂,在磷酸盐缓冲液体系(Na2HPO4-Na H2PO4,100mmol/L,pH=7.0)中有效拆分250mmol/L对氯环氧苯乙烷(rac-p CSO)制备(R)-p CSO(ees>99%)。随后,依据6种非离子型表面活性剂对E.coli/pveh1Z4X4-59全细胞酶活力和对映选择性的影响,筛选吐温-20作为最佳添加剂,构建并优化吐温-20/缓冲液反应体系。在最优反应条件下,吐温-20的添加量为4%(体积分数),E.coli/pveh1Z4X4-59全细胞的添加量为200 g/L,反应时间为12 h,初始底物浓度显著提高至800 mmol/L(123.7 g/L),获得(R)-p CSO的ees和产率分别为99%和45.7%(理论产率为50%),时空产率高达4.71 g/(L·h)。反应体系放大至100 mL后,制备4.5 g(R)-p CSO的总收率为36.3%。
- 王婷婷董文彦胡蝶李闯胡博淳邬敏辰
- 关键词：动力学拆分生物工程
- 乳糖诱导重组大肠杆菌表达胆固醇氧化酶的研究被引量：2
- 2011年
- 采用乳糖诱导胆固醇氧化酶(COD)基因在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,研究了培养基成分、乳糖浓度、诱导时间和诱导温度对胆固醇氧化酶表达的影响。结果显示,在对诱导条件进行优化控制的前提下,胆固醇氧化酶酶活达到15.2 U/mL。研究结果为乳糖作为诱导剂最终应用于重组基因工程药物的工业化生产提供了有益的参考和借鉴。
- 李闯孙艳张玲杨海麟王武
- 关键词：胆固醇氧化酶乳糖诱导
