王思远
- 作品数：2 被引量：0H指数：0
- 供职机构：南华大学更多>>
- 发文基金：湖南省教育厅优秀青年基金湖南省教育厅科研基金国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：生物学更多>>
- 靶向Smad4基因shRNA质粒表达载体的构建及筛选
- 2010年
- 目的:构建编码Smad4 mRNA的shRNA真核表达载体,并筛选出基因沉默效果最明显的shRNA质粒表达载体。方法:根据GenBank提供的人Smad4基因的mRNA序列构建2个shRNA质粒表达载体和1个阴性对照质粒表达载体,并通过基因测序进行鉴定。经鉴定后转染体外培养人成纤维细胞,western-blot检测Smad4蛋白水平抑制表达效果。结果:构建质粒表达载体测序结果显示,插入片段测序结果与合成的shRNA序列一致;靶向Smad4基因shRNA质粒表达载体对所转染的人成纤维细胞中Smad4蛋白水平表达均有抑制作用,其中shRNA1最为明显。结论:成功构建了靶向Smad4基因shRNA质粒表达载体,其中抑制Smad4基因表达效果最为明显的是shRNA1,为进一步研究Smad4基因的RNA干扰奠定了基础。
- 张彩平龙石银田英何云武崔慧辉王思远
- 关键词：RNA干扰SMAD4基因基因克隆
- Smad4基因siRNA表达载体的构建与鉴定
- 2009年
- 目的:以Smad4基因为靶标构建小干扰RNA(siRNA)真核表达载体。方法:根据GenBank公布的人Smad4核酸序列及SiRNA设计原则,用AmbionRNAi在线软件,筛选得到2个19bp片段为靶序列,合成两端带有BamHⅠ、HindⅢ酶切位点的发夹结构寡核苷酸序列,经过退火,将此序列克隆到真核表达质粒pSilencerTM3.1-H1neovector中,构建成重组质粒,酶切及测序验证。脂质体介导转染人原代增生性瘢痕成纤维细胞,经G418筛选细胞克隆,并用RT-PCR检测Smad4基因的表达。结果:成功构建了pSilencerTM3.1-H1neo-Smad4shRNA表达载体克隆,插入片段测序结果与合成的siRNA序列一致。RT-PCR结果显示转染shRNA1、shRNA2重组质粒的成纤维细胞内Smad4 mRNA水平均降低,其中以pSilencerTM3.1-H1-Smad4 shRNA1更为明显(P<0.01)。结论:构建p-Smad4 shRNA表达载体成功,为进一步研究Smad4基因的RNA干扰奠定了基础。
- 何云武张彩平龙石银王思远崔慧辉雷小勇
- 关键词：RNA干扰SMAD4成纤维细胞转化生长因子Β
