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布鲁杆菌Ⅳ型分泌系统蛋白VirB9免疫原性检测被引量：1: 2013年; 目的检测布鲁杆菌Ⅳ型分泌系统蛋白VirB9的免疫原性，寻找潜在的、新的布鲁杆菌亚单位疫苗靶标。方法采用双酶切的方法，将布鲁埃希菌VirB9基因全长克隆至原核表达载体pET32a上，将克隆后载有VirB9基因的pET32a质粒转化至大肠杆菌BL21（DE3）中，异丙基-13-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导重组VirB9蛋白在大肠埃希菌中的表达。利用重组VirB9蛋白所携带的His标签，通过Ni—NAT层析，纯化在大肠杆菌中重组表达的VirB9蛋白．再通过十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶（SDS—PAGE）电泳和二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量试剂盒对纯化的蛋白进行纯度及浓度检测。用布鲁杆菌疫苗株S19株免疫BALB／c小鼠，并以磷酸盐缓冲液（PBS）为对照。在免疫4周后，鼠尾取血，血清虎红平板凝集试验、试管凝集试验检查小鼠血清抗体；酶联免疫吸附试验（ELISA）检测$19株免疫小鼠体内抗VirB9抗体滴度。在免疫后第35天，取小鼠脾脏，分离脾细胞，利用Elispot技术，检测VirB9蛋白体外再刺激后分泌细胞因子（干扰素-1，IFN-1）的脾细胞数，酶联斑点图像仪计数斑点，每个斑点代表1个抗原特异性T淋巴细胞，分析VirB9刺激机体产生细胞免疫反应的情况。结果通过酶切克隆的方法成功地将VirB9全长基因741bp克隆至pET32a载体上。SDS—PAGE显示，VirB9蛋白的相对分子质量约43×103，纯度超过97％；BCA法检测，蛋白浓度为1．6异／L。免疫组小鼠血清虎红平板凝集试验阳性，试管凝集试验小鼠血清抗体滴度〉1：800；对照组小鼠血清虎红平板凝集试验阴性，试管凝集试验小鼠血清抗体滴度阴性。免疫组检测到抗VirB9蛋白抗体，抗体滴度均〉1：3200，对照组小鼠体内未检测到抗VirB9蛋白抗体的存在。酶联斑点图像分析显示，用VirB9蛋白体外刺激，免疫组小鼠5×10s个脾细胞中有147个细胞可以分泌IFN-r�; 范金明王发兴张波江玲李蓓; 关键词：布鲁杆菌免疫原性疫苗

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张波

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