侯丽娜
- 作品数：6 被引量：11H指数：2
- 供职机构：内蒙古农业大学兽医学院更多>>
- 发文基金：内蒙古自治区科技计划项目国家科技支撑计划内蒙古自治区自然科学基金更多>>
- 相关领域：农业科学生物学更多>>
- 绵羊肺炎支原体免疫组织化学及间接免疫荧光检测方法的建立被引量：8
- 2017年
- 以病理组织学观察为基础,建立检测绵羊肺炎支原体的间接免疫组织化学和间接免疫荧光方法,以绵羊肺炎支原体标准血清为一抗,分别以家兔抗山羊Ig G-HRP和家兔抗山羊Ig G-FITC为二抗,对绵羊肺炎支原体阳性肺组织切片及阴性对照组切片进行HE染色、免疫组织化学染色及间接免疫荧光染色,并优化染色条件,以确保组织切片在最佳的条件下进行鉴定。结果显示,本试验所建立的免疫组织化学方法与PCR方法对病样的检出率相符,且高于传统的分离培养法。结果表明,本试验建立的间接免疫组织化学方法和间接免疫荧光方法可用于对临床病例的组织样本检测,具有很强的特异性和可靠性,可直观地观察和探究该病原在机体内的定位、动态分布以及致病机理,以期为临床诊断提供更可靠的方法。
- 张建华黄海碧王晓晖白帆史晓娜高媛王力强侯丽娜郝永清
- 关键词：绵羊肺炎支原体免疫荧光免疫组织化学
- 布鲁菌Rev.1株eryA基因的原核表达及间接ELISA方法的建立
- 2020年
- 通过对布鲁菌优势抗原eryA基因进行原核表达,在获得目的蛋白的基础上建立以该蛋白为包被抗原的间接ELISA方法。构建原核表达载体pET-30a-eryA,并将其转入大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,镍柱亲和纯化eryA重组蛋白,SDS-PAGE鉴定纯化蛋白,Western-Blotting检测反应原性后建立间接ELISA方法。反应条件优化后,抗原包被浓度为0.3125μg/mL,37℃包被2 h;封闭液为5%猪源明胶,37℃作用2 h;血清稀释度为1∶100,37℃作用1 h;酶标抗体稀释度为1∶8000,37℃作用45 min。血清稀释度为1∶1600时,仍然检测为阳性,证明建立的间接ELISA方法灵敏性良好;其他菌种及病毒经过特异性检测,均为阴性,证明建立的间接ELISA方法特异性良好;通过重复性检测,批间及批内变异系数均小于10%,证明建立的间接ELISA方法重复性良好。检测临床血清样品,建立的方法与试管凝集试验总符合率为95.7%,证明该方法可初步应用于临床诊断。
- 程家海宋前进郭昊侯丽娜杨超王凤雪关平原温永俊
- 关键词：原核表达间接ELISA
- 牛结节性皮肤病病毒L1R基因的原核表达及多克隆抗体的制备
- 2022年
- 为了获得牛结节性皮肤病病毒(Lumpy skin disease virus,LSDV)L1R蛋白及其多克隆抗体,试验根据GenBank已公布的LSDV L1R蛋白的编码区合成序列,将合成序列插入原核表达质粒pET-32a,构建pET32a-L1R重组阳性质粒,转化至BL21(DE3)大肠杆菌感受态,用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达。对诱导表达的重组蛋白采用镍离子亲和层析柱进行纯化,通过透析进行纯化蛋白的复性,用Western-blot对复性后的蛋白进行鉴定。将鉴定成功的蛋白免疫Balb/c小鼠制备多克隆抗体,采用间接ELISA测定多克隆抗体的效价。结果表明:L1R蛋白在大肠杆菌中高效表达,在1 mmol/L IPTG、37℃、200 r/min条件下,主要以包涵体的形式表达且纯度较高,表达的蛋白质分子质量约为40 ku,与预期的蛋白质大小一致。纯化后的L1R重组蛋白能被His单克隆抗体及山羊痘阳性血清识别,反应原性良好。制备的小鼠抗LSDV L1R多克隆抗体效价可达1∶102400,免疫原性良好。说明试验成功在大肠杆菌中表达LSDV L1R重组蛋白,并制备获得多克隆抗体。
- 侯丽娜刘晓婷郭昊刘春羽赵洪哲温永俊王凤雪
- 关键词：原核表达包涵体
- 牛传染性鼻气管炎病毒SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法的建立被引量：2
- 2022年
- 为检测牛传染性鼻气管炎病毒,通过设计针对gB基因的特异性引物扩增gB基因,构建阳性重组质粒。经过优化建立了牛传染性鼻气管炎病毒的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法。结果显示,建立的实时荧光定量PCR检测方法在阳性标准质粒拷贝数在5.474×10~4~5.474×10^(9)拷贝/μL时线性关系良好,线性相关系数R^(2)=0.9993。该方法最低检测限为5.747×10^(2)拷贝/μL;可以特异性检测牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV),与牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛副流感病毒(BPIV)、牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)不发生交叉反应。病毒滴度与拷贝数的线性关系良好,线性相关系数R^(2)=0.9854。该方法为牛传染性鼻气管炎病毒的快速检测提供了技术支持。
- 王亚新刘春羽侯丽娜温永俊王凤雪
- 关键词：牛传染性鼻气管炎GB基因
- PRRSV GP4蛋白的原核表达及单克隆抗体的制备
- 2024年
- 猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)给养猪业带来巨大经济损失,尽快建立该病毒的快速诊断方法尤为重要。PRRSV ORF4基因编码的结构蛋白GP4为病毒感染所必须。本研究为制备GP4单克隆抗体,选取ORF4优势序列优化合成,连入pET-32a原核表达载体,构建重组质粒pET-32a-ORF4;经双酶切验证后,转化至BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达并纯化;经SDS-PAGE及Westernblot鉴定成功后免疫小鼠,制备筛选单克隆抗体,对制备的单克隆抗体进行验证。结果表明,GP4蛋白以可溶形式表达,大小为30 kDa;纯化蛋白免疫小鼠后,共筛选4株IgG亚型阳性杂交瘤细胞株;所制备单克隆抗体可与抗原特异性结合。本研究为PRRSV诊断方法的建立及后续研究奠定了基础。
- 郭昊乌东高娃赵洪哲刘春羽侯丽娜王凤雪温永俊
- 关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒原核表达单克隆抗体
- 牛传染性鼻气管炎病毒gI蛋白截短表达与单克隆抗体制备被引量：1
- 2022年
- 为获得牛传染性鼻气管炎病毒(infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV)gI蛋白单克隆抗体,构建了gI截短基因重组原核表达质粒pET-32a-gI,并对其进行了诱导表达和纯化,通过SDS-PAGE和Western blot验证了gI蛋白在大肠杆菌内的表达情况。将纯化的gI蛋白免疫BALB/c小鼠,通过细胞融合、筛选及亚克隆,得到针对IBRV gI蛋白的单克隆细胞株gI14。利用体内诱生法制备抗IBRV gI蛋白单克隆抗体腹水,使用Western blot和间接免疫荧光(IFA)对单克隆抗体特异性进行检测和验证。Western blot结果显示:原核表达的gI融合蛋白相对分子质量为34 ku,gI蛋白单克隆抗体与gI表达蛋白反应性良好,与pET-32a(+)空载体蛋白无特异性结合;天然表达的gI蛋白相对分子质量为45 ku,gI蛋白单克隆抗体与细胞内感染的IBRV所表达的gI蛋白反应性良好。IFA结果显示,gI蛋白单克隆抗体及阳性对照组IBRV多抗均能与细胞内感染的IBRV发生特异性结合,使细胞出现特异性绿色荧光信号,而空白及阴性对照组均未见绿色荧光信号。结果表明,本研究基于高效表达的gI蛋白,成功制备了1株能稳定表达gI单克隆抗体的细胞株gI14,获得的gI蛋白单克隆抗体与原核表达的gI蛋白及IBRV全病毒均能特异性结合,这为进一步研制IBRV诊断试剂盒及探究IBRV gI蛋白抗原表位及蛋白功能奠定了基础。
- 侯丽娜于明华刘春羽赵洪哲郑秉武温永俊王凤雪
- 关键词：牛传染性鼻气管炎病毒原核表达单克隆抗体
