吴慧娜
- 作品数：8 被引量：9H指数：2
- 供职机构：潍坊医学院基础医学院山东省高校免疫学重点实验室更多>>
- 发文基金：教育部科学技术研究重点项目山东省优秀中青年科学家科研奖励基金国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 小鼠IL-1β在H22细胞的表达及对NK细胞杀伤活性的影响被引量：5
- 2007年
- 目的:重组表达小鼠IL-1β全长基因,转染H22肝癌细胞,分析对NK细胞杀伤活性的影响。方法:构建小鼠IL-1β重组表达载体pIRES2-EGFP-mIL-1β,利用jetPEI转染H22肝癌细胞,RT-PCR和激光扫描共聚焦显微镜分析IL-1β重组载体的表达,MTT方法分析转染前后,野生型小鼠脾脏NK细胞对H22细胞杀伤活性的变化。结果:RT-PCR扩增出小鼠IL-1β,长度约843bp。纯化的PCR产物与pIRES2-EG-FP同时经XhoI和EcoRI双酶切,在T4连接酶作用下连接,转化大肠杆菌,提取质粒经PCR、限制性酶谱分析(XhoI+EcoRI)和DNA序列测定后,确认获得重组表达载体pIRES2-EGFP-mIL-1β。将该质粒转染至H22小鼠肝癌细胞中,RT-PCR和荧光观察证实,H22细胞能表达高水平IL-1β重组表达载体,与转染空载体的对照组细胞相比,IL-1β转基因后H22细胞对NK92细胞杀伤抵抗性明显增强,同时野生型小鼠脾脏NK细胞对pIRES2-EGFP-mIL-1β转基因细胞的杀伤活性明显下降,效靶比40:1时下降了约10%。结论:IL-1β能够明显增强H22肝癌细胞对NK细胞杀伤的抵抗性,可能是肝癌细胞借以逃逸天然免疫应答的重要机制。
- 肖伟玲梁淑娟牟东珍王雪净吴慧娜
- 关键词：IL-1ΒNK细胞天然免疫肝癌
- IL-1β反义RNA在HepG2细胞的表达及对NK细胞杀伤活性的影响
- 2007年
- 目的:构建IL-1β反义RNA真核表达载体,转染HepG2细胞,探讨阻断IL-1β作用后对其NK细胞杀伤敏感性的作用。方法:RT-PCR方法扩增两段基因序列IL-1β1(17-331,315bp)和IL-1β2(246-505,260bp),经T-A克隆后构建反义RNA表达载体pcDNA3.0-antiIL1β1和pcDNA3.0-anti-IL1β2。采用阳离子聚合物(jetPEI)的方法转染HepG2肝癌细胞,RT-PCR方法检测反义RNA的表达水平,胞内因子染色的方法分析IL-1的表达水平,MTT方法分析NK-92细胞对HepG2杀伤活性的变化。结果:以LPS刺激的人PBMC总RNA为模板,RT-PCR扩增得到两个约315bp和260bp的基因片段,先构建克隆载体pMD18T-IL-1β1和pMD18T-IL-1β2,质粒PCR、XhoI酶切和DNA序列分析正确后,利用PfuDNA聚合酶进行PCR,产物纯化后经EcoRI、XhoI双酶切,反向插入pcDNA3.0,获得人IL-1β反义RNA真核表达载体pcDNA3.0-antiIL-1β1和pcDNA3.0-antiIL-1β2。PCR、PstI酶切和DNA序列分析正确后,将其分别转染HepG2细胞,RT-PCR检测显示HepG2细胞能够高水平表达两种反义RNA,胞内因子染色发现IL-1β的表达水平明显下降,同时该细胞对NK-92杀伤的敏感性明显升高,其中IL-1β1反义RNA的作用更为显著,效靶比10∶1时,NK细胞对HepG2的杀伤活性提高了约20%。结论:以促炎性细胞因子IL-1β为靶点进行干预,能够有效地下调肝癌细胞对NK细胞杀伤的抵抗能力。
- 梁淑娟肖伟玲牟东珍吴慧娜王雪净
- 关键词：IL-1Β反义RNANK细胞天然免疫
- 肝癌组织特异性P_(afp)IRES2-EGFP表达载体的构建及表达
- 2008年
- 目的构建AFP最小启动子调控的小鼠肝癌组织特异性表达载体,观察其在小鼠H22肝癌细胞中的特异性表达。方法从H22细胞总DNA和荧光载体pIRES2-EGFP中分别PCR扩增AFP最小启动子区序列和CMV增强子(ECMV),利用重叠延伸PCR方法(SOE)获得AFP启动子驱动的嵌合调控序列,将其克隆入pIRES2-EGFP载体,进行菌落PCR、限制性酶谱分析、DNA序列测定。通过jetPEI方法转染H22肝癌细胞和YAC1淋巴瘤细胞,荧光显微镜下观察其表达的组织特异性。结果从小鼠H22细胞DNA和pIRES2-EGFP中分别扩增得到229bp和324bp的片段,纯化后的PCR产物通过SOE扩增得到一537bp的条带,均与预期序列长度一致。SOE产物与pIRES2-EGFP连接,菌落PCR鉴定获得数个阳性克隆,质粒经Nde I+NheⅠ限制性酶谱分析酶解出537bp条带,DNA序列分析证实重组载体中的嵌合DNA与GeneBank中小鼠AFP启动子和ECMV序列完全一致。结论本研究成功构建了AFP启动子调控的小鼠肝癌组织特异性表达载体PafpIRES2-EGFP,该载体能够在小鼠肝癌细胞中特异性表达外源基因。
- 牟东珍梁淑娟刘艳艳王雪净吴慧娜李若葆
- 关键词：肝癌组织特异性表达AFP启动子
- IL-1β反义RNA在肝癌细胞的表达及对NK细胞免疫杀伤的影响
- 目的:构建IL-1β反义RNA真核表达载体,转染HepG2细胞,探讨阻断IL-1β作用对NK细胞杀伤肝癌细胞活性的影响。方法:密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMCs),LPS诱导4小时,RT-PCR分别扩增IL-...
- 牟东珍肖伟玲梁淑娟吴慧娜王雪静
- 关键词：肝癌细胞IL-1Β反义RNANK细胞天然免疫
- 文献传递
- 肝癌细胞特异性IL-1β反义RNA对小鼠移植肝癌的抑制被引量：5
- 2009年
- 目的:构建肝癌细胞特异性小鼠IL-1β反义RNA表达载体,观察其对H22肝癌细胞小鼠移植瘤生长的影响及其相关机制。方法:构建由AFP最小启动子和CMV增强子嵌合序列调控的携IL-1β反义RNA表达载体pafpIRES2-antiIL-1β1和pafpIRES2-antiIL-1β2,经质粒PCR、限制性酶谱分析、序列测定进行鉴定。反义RNA表达载体转染小鼠H22肝癌细胞,分H22/mock组、H22/antiIL-1β1组、H22/antiIL-1β2三组,RT-PCR检测IL-1β的表达水平。以转染后的H22细胞皮下接种建立荷肝癌小鼠模型,观察移植瘤体积和重量,MTT法检测荷瘤小鼠脾脏中分离的NK细胞对H22细胞的杀伤活性。结果:经质粒PCR、限制性酶谱分析、序列测定证实成功构建能够在肝癌细胞中特异性表达IL-1β反义RNA的表达载体pafpIRES2-anti-IL-1β1和pafpIRES2-antiIL-1β2,转染H22细胞后细胞中IL-1β表达水平明显下降,以pafpIRES2-antiIL-1β2更为显著。成功建立荷肝癌小鼠模型,与H22/mock组小鼠相比,H22/antiIL-1β2组小鼠移植瘤体积较小,生长显著减慢(P<0.05)。H22/anti-IL-1β1、H22/antiIL-1β2组荷瘤小鼠的NK细胞对H22细胞的杀伤活性明显增强(P<0.05或P<0.01)。结论:成功构建的肝癌细胞特异性IL-1β反义RNA表达载体可有效抑制小鼠移植肝癌的生长,其机制与靶向阻断IL-1β表达、上调NK细胞的杀伤活性有关。
- 刘艳艳梁淑娟王焕芹张素华肖伟玲吴慧娜
- 关键词：肝癌白细胞介素1Β反义RNANK细胞
- 人IL-1β真核表达载体的构建及对NK细胞杀伤敏感性的影响
- 目的:构建人IL-1的真核表达载体,转染H7402肝癌细胞,观察IL-1β在肝癌细胞中的表达及对NK细胞介导的细胞毒活性的影响,从而为促炎性细胞因子与肝癌天然免疫逃逸关系的假说提供理论依据。方法:密度梯度离心的方法分离外...
- 梁淑娟肖伟玲牟东珍吴慧娜王雪静
- 关键词：IL-1ΒNK细胞天然免疫促炎性细胞因子
- 文献传递
- IL-1β反义RNA表达载体的构建及对肝癌细胞中IL-1β水平的影响
- 2008年
- 目的构建小鼠IL-1β反义RNA表达载体,观察对肝癌细胞中IL-1β表达的阻断效果。方法提取细胞总RNA,RT-PCR扩增IL-1β1和IL-1β2,将其反向连接到肝癌组织特异性表达载体PafpIRES2-EGFP,构建PafpIRES2-antiIL-1β1和PafpIRES2-antiIL-1β2反义RNA表达载体,利用jetPEI转染H22肝癌细胞和YAC-1淋巴细胞,荧光显微镜下观察反义RNA载体的表达,RT-PCR方法分析H22细胞中IL-1β表达水平的变化。结果RT-PCR扩增到两条长度分别为264和284bp的片段,与IL-1β1和IL-1β2相符,将其反向与PafpIRES2-EGFP连接,经菌落PCR和DNA序列分析证实,获得了PafpIRES2-antiIL-1β1和PafpIRES2-antiIL-1β2反义RNA表达载体。上述载体转染H22细胞后,荧光显微镜下可见细胞表达出明亮绿色荧光,而YAC-1细胞则未见荧光。RT-PCR分析证实转染反义RNA后H22细胞中IL-1β表达水平明显下降,尤以IL-1β2反义RNA的阻断效果更为显著。结论成功构建了小鼠IL-1β肝癌细胞特异性反义RNA表达载体PafpIRES2-antiIL-1β1,PafpIRES2-antiIL-1β2,两载体能有效地阻断肝癌细胞中IL-1β的表达。
- 梁淑娟吴慧娜肖伟玲牟东珍刘艳艳
- 关键词：IL-1Β反义RNA肝癌
- 小鼠IL-1β真核表达载体在H22细胞的表达及对其增殖和转移的作用
- 目的:构建小鼠IL-1β真核表达载体,瞬时转染小鼠H22肝癌细胞,观察H22细胞小鼠体内外肿瘤生长、转移和NK细胞天然免疫应答的影响。方法:常规分离Balb／c小鼠外周血单个核细胞,LPS(5 g／ml)刺激4小时,RT...
- 肖伟玲梁淑娟牟东珍吴慧娜王雪静
- 关键词：IL-1Β肝癌NK细胞天然免疫
- 文献传递
