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人星状病毒I型非结构蛋白nsP1a及其C末端蛋白nsP1a/4的原核表达及鉴定被引量：1: 2015年; 人星状病毒(Human Astrovirus,HastV)是导致婴幼儿腹泻的重要病原体。HastV非结构蛋白nsP1a及C末端蛋白nsP1a/4含有各种保守的功能结构域,在星状病毒的复制、转录,病毒与宿主的相互作用中起重要作用。为获得nsP1a及其nsP1a/4蛋白,为后续蛋白相关研究提供平台,本研究在E.coli系统中进行人星状病毒非结构蛋白nsP1a及nsP1a/4蛋白的表达并对表达产物进行鉴定。首先将nsP1a及nsP1a/4基因克隆入原核表达载体PGEX-4T-1,构建nsP1a及nsP1a/4蛋白融合表达质粒;在E.coli BL21(DE3)中进行IPTG诱导表达,摸索两种融合蛋白表达的最优条件并对表达蛋白进行免疫印迹鉴定。结果表明nsP1a蛋白在30℃,1mM IPTG诱导12h时,蛋白表达量达到最高;nsP1a/4蛋白在20℃,0.5mM IPTG诱导8h时,蛋白表达量达到最高。Western blot结果显示两种融合蛋白既可与nsP1a蛋白免疫血清发生特异性反应,也可被GST标签抗体所识别。本研究成功利用原核系统表达并鉴定了人星状病毒非结构蛋白nsP1a及其C末端蛋白nsP1a/4,为进一步研究星状病毒非结构蛋白的功能及病毒的致病机制奠定基础。; 刘文慧阚丽丽崔永胜谭李倩梁雪雪李新赵微; 关键词：原核表达融合蛋白

人CD63真核表达质粒的构建及在TCA8113细胞中的表达与定位被引量：1: 2015年; 目的构建人CD63真核表达质粒,观察其在人舌鳞癌细胞TCA8113中的表达与定位。方法提取TCA8113细胞总RNA,RT-PCR方法扩增CD63全长基因序列,亚克隆至pc DNA3.1真核表达质粒中,构建pc DNA3.1-CD63表达质粒,转化E.coli DH5α,筛选阳性克隆,酶切及测序鉴定正确后,将重组质粒转染TCA8113细胞,Western blot检测蛋白表达,间接免疫荧光方法观察CD63蛋白在TCA8113细胞中的表达与定位。结果成功构建了pc DNA3.1-CD63真核表达质粒,Western bolt结果检测到外源CD63高表达,间接免疫荧光结果表明CD63融合蛋白与内源CD63蛋白定位相似,均表达于细胞膜。结论外源CD63融合蛋白能在TCA8113中高表达并定位于细胞膜。; 刘文慧阚丽丽侯美玲梁雪雪赵微李新; 关键词：CD63 真核表达免疫荧光舌癌

舌鳞癌侵袭转移相关蛋白CD63-LEL结构域表达及纯化: 2016年; 目的构建p ET-29a-CD63-LEL重组质粒,诱导蛋白表达,鉴定表达产物并纯化蛋白,为后续研究CD63-LEL蛋白对人舌鳞癌侵袭转移的影响奠定基础。方法根据美国国立生物技术信息中心(NCBI)中查询到的CD63-LEL基因序列,运用RT-PCR技术从TCA-8113细胞中获得CD63-LEL的c DNA序列,经PCR、双酶切及测序确定获得p ET-29a-CD63-LEL重组载体后,转化至大肠埃希菌E.coli BL21(DE3)感受态中,通过异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isopropylthio-β-Dgalactoside,IPTG)诱导表达,运用镍柱亲和层析法纯化获得p ET-29a-CD63-LEL融合蛋白。结果成功构建了p ET-29aCD63-LEL重组质粒,经SDS-PAGE凝胶电泳检测:在37℃,1 mmol/L IPTG诱导12 h p ET-29a-CD63-LEL蛋白表达量高;在咪唑浓度为MCAC-80/100/200/500条件下可洗脱目的蛋白,Western blot检测Ni-NTA agarose纯化蛋白大小位于26 k U和35 k U处。结论在大肠埃希菌中获得了p ET-29a-CD63-LEL蛋白的大量表达,经镍柱亲和层析可得到较纯的p ET-29aCD63-LEL蛋白。; 侯美玲梁雪雪谭李倩刘文慧王文赵微李新; 关键词：舌鳞癌蛋白表达

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李新