李婕
- 作品数：3 被引量：4H指数：2
- 供职机构：清华大学生命科学学院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：生物学更多>>
- 简单节杆菌3-甾酮-△~1-脱氢酶基因的克隆表达及定点突变研究被引量：2
- 2017年
- 目的:将来源于简单节杆菌的3-甾酮-△~1-脱氢酶(3-ketosteroid-Delta(1)-dehydrogenase,KSDD)在大肠杆菌中进行表达,获得具有活性的脱氢酶;利用计算机预测KSDD的三级结构,并通过定点突变确定酶的关键位点以期优化脱氢酶的活性及性质。方法:克隆简单节杆菌编码KSDD的基因ksdd构建原核表达载体,以Escherichia coli BL21(DE3)为表达宿主构建重组菌并诱导表达,HPLC法检测重组酶催化4-AD脱氢的转化率;通过SWISS-MODEL同源建模分析KSDD结构,对预测的催化关键位点氨基酸残基进行定点突变并研究突变后重组酶的活性变化。结果:成功构建了表达脱氢酶KSDD的重组菌E.coli pET-22-ksdd,21℃下诱导表达后,重组酶对4-AD的转化率为27%;通过SWISS-MODEL同源建模预测出脱氢酶结构并对4个关键位点进行定点突变设计,获得突变子Y120R、Y320L、Y488F和G492Y。突变子Y120R和Y488F失活,证明其为酶的活性位点;突变子Y320L的转化率与野生型基本一致,但37℃反应条件下稳定性有所提高;突变子G492Y对4-AD的转化率是野生型的1.2倍,37℃条件下稳定性有所提高,是突变后氨基酸位点疏水性增加和周围静电作用改变所导致。结论:目前对简单节杆菌3-甾酮-△~1-脱氢酶结构分析及催化机理相关的研究较少,本研究验证了KSDD的活性位点,优化了酶的稳定性,为进一步对酶的性质进行定向改造打下了基础。
- 李婕余磊赵晓雅郑桂兰王洪钟
- 关键词：简单节杆菌同源建模定点突变
- 3β-羟基类固醇脱氢酶基因的克隆表达及其性质研究
- 2018年
- 目的:构建3β-羟基类固醇脱氢酶(3β-HSD)异源表达系统,进一步探究其酶学性质。方法:通过分子生物学方法克隆来源于Mycobacterium neoaurum菌株的3β-羟基类固醇基因,构建重组质粒,运用HPLC方法检测酶反应体系的产物。结果:本实验构建了表达载体pet28a-hsd。优化诱导表达条件,发现3β-HSD异源表达的最适温度为16℃~25℃,37℃时蛋白表达为包涵体。此外,同一温度下不同IPTG浓度诱导的表达结果差异不大。利用纯化后的蛋白进行酶特性的研究,结果表明在3β-HSD酶反应体系中,30℃达到较高的酶活性;pH 7.5~9.0之间,酶活力较强,pH低于7.0时,酶活性明显下降;有机助溶剂DMSO对酶反应有抑制作用;Fe^(3+)和Cu^(2+)对酶反应有抑制作用。结论:本实验探究了分枝杆菌中3β-羟基类固醇脱氢酶的相关性质,为进一步研究该酶在类固醇代谢中的功能提供基础。
- 赵晓雅李婕余磊郑桂兰王洪钟
- 关键词：类固醇酶活性
- 基于酵母表面展示技术的胸苷磷酸化酶全细胞催化剂的构建被引量：2
- 2016年
- 胸苷磷酸化酶(TP)在核苷类代谢通路中发挥重要作用,可催化生成多种核苷类似物。构建了TP的酵母表面展示系统作为全细胞催化剂。从大肠杆菌K12菌株中克隆编码TP的deo A基因,利用酵母表达质粒p KFS构建重组质粒,电击转化毕赤酵母GS115菌株。高拷贝阳性转化子经甲醇诱导96 h后,免疫荧光结果显示TP在酵母细胞表面成功展示。利用β-胸苷为底物,重组酵母细胞作为全细胞催化剂,经HPLC检测,结果表明展示在酵母表面的TP有催化活性,可以催化β-胸苷生成产物胸腺嘧啶。
- 王洁余磊杨东李婕王洪钟
- 关键词：胸苷磷酸化酶全细胞催化毕赤酵母
