马闪闪
- 作品数：4 被引量：15H指数：2
- 供职机构：河南农业大学生命科学学院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金河南省科技攻关计划更多>>
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- 自我延伸过程对木聚糖酶-CBM融合基因的影响
- 2013年
- 探讨了木聚糖酶-纤维素结构结合结构域(CBM)基因融合过程,在不加引物而只用两种DNA片段经PCR扩增全长融合基因,从而证明了自我延伸过程的存在,是指互补匹配的两段DNA互为引物、互为模板在聚合酶作用下合成融合基因的过程,从理论上阐明了PCR中的自我延伸过程。在传统PCR中加入3次循环的自我延伸程序(94℃×1 min,52℃×1 min,72℃×1 min),融合基因扩增量要更多。进而探讨自我延伸程序中延伸时间的影响,发现延伸时间2、3、5 min扩增的融合基因量显著增强;而延伸时间为1 min时,融合基因条带的亮度增加不明显,说明延伸时间是增加扩增量的关键因素。
- 闫鹏飞马闪闪赵黎胡瑜刘亮伟
- 关键词：融合PCR融合基因
- 构建重组质粒的二步PCR方法被引量：10
- 2015年
- 建立一种简单的重组质粒构建方法——二步PCR,不需要限制性内切酶对基因和载体进行酶切.第一步常规PCR中,用正向引物(IF)和反向杂合引物(IR)扩增黑曲霉木聚糖酶Xyn基因,IF与基因特异性匹配,IR引物3’端与基因序列匹配、5’端含有19 bp p ET20b一端正链序列;第二步反向PCR中,以扩增的Xyn基因作为正向引物,其3’端含有19 bp与环状p ET20b模板退火、并在高保真Q5 DNA聚合酶作用下延伸,与模板另一端互补的反向引物VR协同作用,重组质粒通过PCR扩增出来.反向PCR产物经T4 DNA连接酶环化,并经Dpn I限制性内切酶消解处理,可以直接转化BL21(DE3)感受态细胞.用这种方法将622、639、1125、1209 bp大小的基因重组p ET20b中,显示出有较广泛的普适性.
- 韩来闯马闪闪刘亚娟刘猛刘亮伟
- 关键词：重组质粒PCR
- CBM2蛋白的高密度自诱导被引量：6
- 2015年
- 为提高外源蛋白表达量,以pET20b载体、BL21(DE3)E.coli宿主细胞,比较了乳糖和IPTG对CBM2(碳水化合物结合结构域)蛋白表达量的诱导效果。ZYM-5052自诱导培养基菌体OD600是IPTG LB培养基菌体的4.4倍。SDS-PAGE显示200μL ZYM-5052菌体细胞含有82.3μg CBM2,占细胞总蛋白55.3%;等量IPTG LB菌体细胞含有16.6μg CBM2,占细胞总蛋白25.7%。取不同培养时间等量等同OD600的ZYM-5052菌体进行SDS-PAGE,结果显示单位细胞中蛋白量随着培养时间而增加。所以高密度自诱导不仅提高了细胞生长密度、而且提高了单位细胞中蛋白表达量。自诱导方案用于表达葡聚糖酶,与IPTG LB菌体相比,自诱导菌体OD600是其2.3倍,酶活性是其4.5倍。该研究为提高外源蛋白表达量提供了较为简单、普适的高密度自诱导方案。
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- 无限制性酶切的高效PCR构建重组质粒
- 与酶切-连接构建重组质粒方法不同,本文建立了不通过限制性内切酶酶切的重组质粒构建方法——二步PCR.第一步常规PCR扩增插入基因片断,用正向引物(IF)和反向杂合引物(IR)扩增黑曲霉木聚糖酶Xyn基因[1],IF与基因...
- 韩来闯马闪闪刘亚娟刘猛刘亮伟
