周文君
- 作品数：3 被引量：10H指数：1
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- RS-1提高CRISPR-Cas9系统介导的人乳铁蛋白基因敲入效率被引量：10
- 2017年
- 尝试利用CRISPR-Cas9系统敲除山羊基因组中β-乳球蛋白(BLG)基因,以实现在BLG基因座敲入人乳铁蛋白(h LF)基因,并进一步探讨了不同浓度RAD51蛋白激活剂(RS-1)对同源重组效率的影响。首先针对山羊BLG的第一外显子设计并构建了sg RNA和Cas9共表达载体p Cas9-sg BLG,将该载体转染至山羊耳成纤维细胞,利用PCR和T7EN1法验证了其基因组编辑活性;然后进一步构建了BLG基因打靶载体p BHA-h LF-NIE(包含NEO/EGFP);将该打靶载体与p Cas9-sg BLG载体共转染至山羊耳成纤维细胞,分别用0、5、10和20μmol/L RS-1处理细胞,分析了绿色荧光蛋白的表达效率;同时用800μg/m L G418对不同浓度RS-1处理后的细胞进行筛选,挑取EGFP阳性细胞克隆,进一步通过PCR和测序鉴定h LF定点敲入的阳性细胞克隆。结果显示:设计的sg RNA编辑山羊BLG位点的效率为25%-31%;报告基因的表达效率提示RS-1可以促进基因敲入效率的提高,其效率与RS-1浓度呈正相关,20μmol/L RS-1处理组的效率是对照组的3.5倍;利用G418筛选h LF敲入阳性细胞克隆后,当RS-1浓度为0-10μmol/L时,h LF敲入效率随着RS-1浓度增加而升高,在10μmol/L时阳性克隆率最高为32.61%,然而在20μmol/L时敲入阳性克隆率下降至22.22%,且衰老细胞克隆增多。以上结果表明,利用CRISPR-Cas9系统可以实现在山羊耳成纤维细胞中敲除BLG基因和敲入h LF基因,且适宜浓度的RS-1可以显著提升基因敲入效率,本试验为高效利用CRISPR-Cas9系统获得基因敲入的细胞提供了参考依据。
- 周文君郭日红邓明田王锋张艳丽
- 关键词：Β-乳球蛋白同源重组人乳铁蛋白
- CRISPR/Cas9技术生产BLG基因敲除山羊的研究
- 引言/目的羊乳含有丰富的营养,但羊乳中含有BLG蛋白,其为羊乳中主要的乳清蛋白,也是主要的过敏原,会引起人体的过敏反应。通过酶水解、加热并不能减少其过敏原性,反而会增加其过敏源性,而发酵工艺又会产生新的副产物。本研究采用...
- 周文君万永杰邓明田张艳丽王锋
- 利用CRISPR/Cas9技术敲除山羊BLG基因与定点整合hLF基因的研究
- 山羊乳含有丰富的营养成分，是一种潜在的人乳替代品。但是，山羊乳中不但含有人过敏原β-乳球蛋白(β-1actoglobulin，BLG)，而且其乳铁蛋白含量远低于人乳。人乳铁蛋白(human lactoferrin,hLF...
- 周文君
- 关键词：基因敲除乳汁
