高雪
- 作品数：16 被引量：29H指数：4
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- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 结核分枝杆菌furA基因片段的克隆、表达和分离纯化被引量：3
- 2004年
- 目的 :获得结核分枝杆菌furA基因片段并高效表达、纯化 .方法 :用PCR技术从MTB毒株H37Rv DNA中扩增出相应大小的DNA片段 ,将片段与pGEM T easy载体连接后测序 .将测序正确的furA按照BamHⅠ和HindⅢ酶切位点克隆入原核表达载体pRSET A ,将连接产物转化入E .coliBL2 1,挑出阳性克隆 ,IPTG诱导表达重组的 (His) 6融合蛋白 .对重组融合蛋白通过镍柱进行纯化 .结果 :PCR获得的furA序列与Genbank报道的一致 (为 4 5 3bp) .重组载体在E .coliBL2 1中以可溶形式高效表达 ,融合蛋白经SDS PAGE和Westernblot分析 ,在Mr 为 2 3.0× 10 3 处有特异的蛋白条带 ,目的蛋白表达量占菌体总蛋白量的 10 % ,重组蛋白经镍柱进行纯化后 ,得到了高纯度的FurA融合蛋白 .结论 :成功克隆结核分枝杆菌furA基因片段 ,并在E .coliBL2 1中高效表达 ,亲和层析纯化后获得高纯度FurA融合蛋白 .
- 高雪薛莹姜泓柏银兰师长宏张海李元徐志凯
- 关键词：分枝杆菌结核克隆纯化
- 结核分枝杆菌furB基因的克隆、表达和纯化被引量：1
- 2004年
- 目的 :从H37Rv基因组中扩增furB并高效表达和纯化 .方法 :用PCR技术从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增furB序列 ,将其与pGEM T Easy载体连接转化E .coliDH5α ,构建重组克隆载体pGEM T Easy/furB ,测序正确后将目的基因片断克隆入pQE 80L原核表达载体并转化E .coliDH5α ,IPTG诱导目的蛋白表达 .经Westernblot鉴定目的基因与 (His) 6融合表达 ,将已表达的蛋白质通过Ni2 + NTA亲和色谱柱进行纯化 .结果 :PCR得到结核分枝杆菌furB ,测序结果与Genbank中报道的完全一致 .SDS PAGE显示 ,在Mr为 15 .0× 10 3 处有相应的蛋白质表达条带 ,Westernblot鉴定为 (His) 6融合表达蛋白 .经Ni2 + NTA亲和色谱柱进行纯化后可得到纯化的蛋白 .结论 :成功克隆了铁调节蛋白基因furB序列 ,并在E .coliDH5α高效表达 ,亲和层析后获得了纯化目的蛋白 .
- 姜泓薛莹高雪师长宏柏银兰张海李元徐志凯
- 关键词：纯化结核分枝杆菌
- 结核分枝杆菌furA基因真核表达质粒的构建及表达被引量：2
- 2005年
- 以BamHⅠ和HindⅢ双酶切pRSET-furA,获得结核分枝杆菌铁调控基因furA,将其克隆入真核表达载体pcDNA3.1(-),构建了重组质粒pcDNA-furA。经酶切鉴定正确后,将重组质粒以阳离子聚合物转染CHO细胞。经RT-PCR分析表明,furA可在CHO细胞中转录;用间接免疫荧光检测,表达有FurA蛋白的细胞着染。以上结果表明,通过构建结核分枝杆菌furA基因的真核表达载体pcDNA-furA,使furA基因可以在CHO细胞中表达。
- 高雪薛莹姜泓柏银兰张海李元徐志凯
- 关键词：结核分枝杆菌基因真核表达
- 结核分枝杆菌FurB基因真核表达质粒的构建及表达
- 2005年
- 目的构建结核分枝杆菌铁调控基因furB真核表达载体。方法以BamHⅠ和HindIII双酶切pQE-80L-furB获得furB基因,克隆入真核表达载体pcDNA3.1(-),重组质粒酶切鉴定后以阳离子聚合物转染COS-7细胞,分别以RT-PCR方法检测mRNA表达和间接免疫荧光技术检测目的蛋白的表达。结果构建了重组质粒pcDNA3.1(-)-furB,RT-PCR结果证明furB可在COS-7细胞中转录,用间接免疫荧光检测,显示COS-7细胞内有FurB蛋白的表达。结论成功构建了结核分枝杆菌furB基因的真核表达载体pcDNA3.1(-)-furB,furB基因可以在COS-7细胞中表达。
- 姜泓高雪张海李元徐志凯薛莹
- 关键词：结核分枝杆菌真核表达
- 抗MTB FurB单克隆抗体制备及特性分析
- 2007年
- 目的制备针对结核分支杆菌FurB蛋白的单克隆抗体(mAb)并分析其特性。方法利用纯化的FurB蛋白,采用腹股沟皮下包埋硝酸纤维素膜和腹腔内注射FurB的方法免疫小鼠,然后进行细胞融合、克隆化制备抗FurB mAb,用Western-blot鉴定其特异性,用ELISA法初步分析其特异性位点和相对亲和力。结果获得3株抗FurB mAb,分别为DD12、BH1和DH8,经Western-blot分析都可与FurB蛋白特异性结合。三株mAb中DH8效价最高达到10-10,相对亲和力,BH1>DH8>DD12,3株mAb的抗原表位相近。结论获得的抗FurB mAb效价高、特异性强,可以作为进一步研究FurB功能和作用的有效工具。
- 姜泓高雪李元张海徐志凯薛莹
- 关键词：分枝杆菌结核单克隆抗体
- 结核分枝杆菌Rv2450基因的克隆、表达及纯化被引量：7
- 2004年
- 目的 :克隆结核分枝杆菌 (Mtb)Rv2 4 5 0基因 ,序列测定正确后进行融合表达、纯化 .方法 :采用聚合酶链反应(PCR)从MtbH37Rv基因组中扩增出Rv2 4 5 0编码基因 ,序列测定正确后 ,亚克隆到融合表达载体 pPro EXHT中 ,转化大肠杆菌DH5α ,目的基因经IPTG诱导 ,由T7启动子调控表达带 6个组氨酸残基的Rv2 4 5 0蛋白 ,在变性条件下对目的蛋白进行亲和层析纯化 .结果 :得到融合 6个组氨酸残基的Rv2 4 5 0蛋白纯度大于 90 % .结论 :构建了MtbRv2 4 5 0基因的重组表达载体 ,并获得了高纯度的融合表达蛋白 .
- 薛莹姜泓高雪柏银兰师长宏张海徐志凯李元
- 关键词：结核分枝杆菌克隆纯化
- 结核分枝杆菌esat6-cfp10融合基因的克隆表达及纯化被引量：3
- 2005年
- 获得esat6-cfp10重组蛋白,为研究其在结核病诊断和预防中的作用奠定一定基础。以结核杆菌H37Rv基因组DNA为模板,克隆cfp10基因,将其插入到pGEM-7ZF(+)克隆载体后与esat6基因连接,构建含有esat6和cfp10融合基因的克隆载体pGEM-e6c10。酶切消化pGEM-e6c10重组质粒,将esat6-cfp10基因亚克隆到pPROEXTM HTb原核表达载体,经IPTG诱导后,可表达出分子量约28 kD的esat6-cfp10融合蛋白,重组蛋白经镍柱纯化后,得到了高纯度的esat6-cfp10融合蛋白。Western blot证明表达重组蛋白有较好的免疫原性。
- 张海师长宏范雄林薛莹柏银兰姜泓高雪徐志凯
- 关键词：ESAT6CFP10融合基因结核分枝杆菌
- 结核分枝杆菌esat6-cfp10融合基因疫苗的构建及表达被引量：5
- 2005年
- 目的:构建结核分枝杆菌esat6 cfp10融合基因疫苗 并对其在体外进行表达.方法:用PCR技术从MTB毒株 H37Rv基因组DNA中扩增cfp10基因,以HindⅢ和EcoRⅠ双 酶切后克隆入含esat6基因的pGEM 7zf(+)载体中,将测序 正确的esat6 cfp10融合基因按照BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点 亚克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+),重组质粒酶切鉴定 正确后以脂质体转染CHO细胞,分别以RT PCR方法检测 mRNA表达和间接免疫荧光技术检测目的蛋白的表达. 结果:PCR获得的cfp10基因序列与文献报道一致,大小约为 350bp.重组真核表达质粒酶切后可获得约630bp的融合 esat6 cfp10基因片段.RT PCR可获得大小约为350bp的 cfp10基因,间接免疫荧光检测后表达有Esat6 Cfp10蛋白的阳 性细胞着染.结论:成功克隆结核分枝杆菌cfp10基因,构建 了融合有esat6 cfp10基因的真核表达质粒并对其在体外进行 了表达.
- 张海师长宏薛莹姜泓高雪柏银兰王丽梅徐志凯
- 关键词：结核分枝杆菌ESAT6CFP10基因疫苗真核表达
- 结核分枝杆菌FurA的基因表达及单克隆抗体的制备
- 结核病/(tuberculosis,TB/)是由结核分枝杆菌/(Mycobacterium tuberculosis,MTB/)所致以呼吸系统感染为主的慢性传染病。目前全球有1//3的人口感染MTB,每年有800万新感染...
- 高雪
- 关键词：结核分枝杆菌单克隆抗体
- 文献传递
- 结核分支杆菌铁调控蛋白FurA的基因表达及单克隆抗体的制备
- 2005年
- 目的表达结核分支杆菌FurA蛋白,并制备针对该蛋白的单克隆抗体(mAb)。方法将重组质粒转化入E.coliBL21,挑出阳性克隆,IPTG诱导表达重组的6×His融合蛋白。采用小鼠腹股沟皮下NC膜免疫的方法免疫小鼠,并进行细胞融合、克隆化制备抗FurAmAb,用ELISA法初步鉴定其特异性位点和相对亲和力。结果获得了高表达的融合蛋白,融合蛋白经SDS-PAGE分析,在相对分子量Mr为23×103处有特异的蛋白条带,为目的蛋白。用该融合蛋白免疫小鼠后,获得了1株抗FurAmAb。结论所获得的抗FurAmAb特异性强、效价高,对进一步研究FurA在结核分支杆菌铁代谢及致病中的作用提供了有力的工具。
- 高雪薛莹姜泓王平柏银兰张海李元徐志凯
- 关键词：分枝杆菌结核单克隆抗体
