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施青青: 作品数：23 被引量：65H指数：4; 供职机构：扬州大学动物科学与技术学院更多>>; 发文基金：国家自然科学基金江苏省高校自然科学研究项目国家教育部博士点基金更多>>; 相关领域：农业科学生物学环境科学与工程更多>>

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睾丸注射Mx基因生产抗病转基因鸡初探被引量：7: 2010年; 采用脂质体转染法,将线性化pcDNA3.0-MMx质粒随机打点注射入18周龄青年公鸡睾丸内,术后观察公鸡日常活动、常规检测精子;采集转染后25、50、75 d公鸡精液,并于转染70 d后人工采精,授精于正常母鸡,产生F1后代,采用常规PCR检测技术,检测证实外源Mx基因的整合情况,探讨外源Mx基因在鸡体内稳定整合和遗传的能力。结果表明:手术法转染外源基因过程对公鸡的生殖功能未造成明显影响;PCR检测证实外源Mx基因已整合到精子基因组,且能通过体外受精传递给后代,后代PCR检测的阳性率为27.27%(6/22)。证明外源Mx基因能稳定整合到基因组上,睾丸内注射法可能是一种切实可行、易于推广的制备抗病转基因鸡的方法。; 孙敏倪黎刚施青青阴彦辉傅德智高波李碧春; 关键词：MX蛋白转基因鸡

鸡Dazl基因的克隆及其亚细胞定位研究被引量：2: 2013年; 为克隆鸡Daz(lDeleted in azoospermia-like,Dazl)基因CDS序列,通过构建eGFP标记的DAZL真核表达载体,实现该基因产物的亚细胞定位以探究其生物信息学功能。提取1日龄鸡睾丸总RNA,通过巢式PCR方法扩增出Dazl基因的CDS,构建真核表达载体pEGFP-C1-DAZL。采用LipofectaminTMLTX介导重组表达载体pEGFP-C1-DAZL转染CEF细胞,48h后于荧光倒置显微镜下观察其表达定位,同时利用RT-PCR和Western-blot进一步鉴定eGFP-Dazl和蛋白水平的表达情况。结果表明:克隆出Dazl基因的完整CDS,长度870bp,共编码289个氨基酸,与公布的鸡Dazl基因(GenBank登陆号:NM_204218)CDS区同源性达99%,编码氨基酸完全一致。酶切鉴定和序列分析均表明真核表达载体pEGFP-C1-DAZL构建成功。转染48h后,RT-PCR和Western-blot分别检测到949bp特异条带和59.7ku的融合蛋白。荧光显微镜观察显示,融合蛋白(eGFP-Dazl)主要分布于细胞核。; 郑蒙蒙李伟施青青王丹黄晓梅李碧春; 关键词：DAZL 真核表达载体绿色荧光蛋白亚细胞定位

BMP4诱导鸡胚胎干细胞向雄性生殖细胞分化的研究被引量：7: 2013年; 旨在探讨BMP4诱导鸡胚胎干细胞向雄性生殖细胞分化的作用机理。采用单层贴壁培养作为分化模式，分别采用10、20、30和40ng·mL-1 BMP4浓度诱导雄性鸡胚胎干细胞，通过形态学、荧光定量PCR和免疫细胞化学检测诱导效果。根据细胞形态变化和差异基因表达量变化，确定了BMP4的适宜诱导浓度为40ng·mL-1。在适宜浓度诱导过程中，诱导4d类胚体开始出现，6～8d类胚体逐渐增大，数量增多，10d部分类胚体开始散开，变为小的圆形细胞，12d在散开后的类胚体周围可观察到少量生殖样细胞，14d生殖样细胞数目增多，且呈聚团生长的趋势。诱导过程中相应基因表达量也发生变化：胚胎干细胞标记基因Nanog、Sox2表达量显著下降（P〈O．01），生殖细胞特异基因Stra8、Dazl、integrina6、c-kit表达量均呈显著上升趋势（P〈O．01）。BMP4可以引起生殖细胞相应基因的表达，促进雄性鸡胚胎干细胞向雄性生殖细胞方向分化，结果为雄性生殖细胞的体外诱导研究提供试验参考，为进一步研究雄性生殖细胞发生和调控机制提供理论基础。; 施青青张振韬李鹏程郑蒙蒙王丹黄晓梅张亚妮李碧春; 关键词：鸡胚胎干细胞雄性生殖细胞分化 BMP4

鸡ES细胞体外定向诱导分化特性的研究被引量：1: 2011年; 旨在探索鸡胚胎干细胞(ES细胞)体外定向诱导的多向分化潜能。分离鸡X期胚盘细胞,体外培养传代,经鉴定后,采用地塞米松(DEX)、β-甘油磷酸钠(β-GP)和维生素C(VitC)诱导ES细胞向成骨细胞分化;采用维甲酸(RA)、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)诱导ES细胞向神经元样细胞分化;采用DEX、胰岛素、IBMX诱导ES细胞向脂肪细胞分化,比较不同浓度组合诱导剂的诱导效果,分别用Von Kossa’s染色法、甲苯胺蓝染色法、免疫组化法、油红O染色法和RT-PCR鉴定诱导产生的细胞。结果显示,ES细胞被诱导3～21d后,分化为成骨细胞,诱导率为40%～72%;被诱导4～7d后,分化为神经元样细胞,诱导率为71%～84%;被诱导2～21d后,分化为脂肪细胞,油红O染色阳性,并表达PPARγ基因。结果表明,在体外条件下,ES细胞可被特异的化学物质定向诱导分化为成骨细胞、神经元样细胞和脂肪细胞,具有多向分化潜能。; 李碧春陈香凝裴敬帅施青青傅德智阴彦辉张振韬窦套存王克华; 关键词：胚胎干细胞体外培养诱导分化

体内精原干细胞介导法制备抗病转基因鸡被引量：1: 2011年; 实验旨在利用精原干细胞介导的方法体内转染融合基因EGFP-MMx,制备抗病毒性疾病转基因鸡。采用脂质体包埋法,睾丸内注射EGFP-MMx融合基因,术后采集30、40、50、60、70、80 d睾丸组织进行冰冻切片、基因组PC R、点杂交实验,转染后60 d公鸡精液人工授精于正常母鸡,对后代血液采用PC R检测技术、R T-PC R和W estern blot方法检测外源基因EGFP-MMx的整合表达情况。结果表明:睾丸基因组点杂交阳性率为72.2%。通过PC R、R T-PCR检测方法,在实验公鸡精液和F1代血液中检测到目的基因,精液阳性率为25%,F1代阳性率为10.53%,Western blot检测F1代阳性率为7.89%。结果证明外源基因通过睾丸注射法可整合到基因组上,为培育抗病转基因鸡提供参考依据。; 孙敏施青青阴彦辉傅德智秦玉蓉许峰李碧春; 关键词：精原干细胞转基因鸡

鸡胚胎干细胞的分离及其嵌合体制备条件探索被引量：2: 2012年; 分离培养鸡胚胎干细胞(ESCs),体外培养传代后,进行碱性磷酸酶活性检测和SSEA-1染色鉴定;并用线性化的质粒pEGFP-N1转染鸡ESCs。受体种蛋经赤道面开窗后,将经转染的ESCs注射到受体鸡胚胚下腔,以便制作嵌合体鸡;对获得的嵌合体鸡分别提取血液和组织DNA后进行PCR检测。结果表明:5只存活的的嵌合体鸡血液中没有发生EGFP基因嵌合,但有4只嵌合体鸡的部分器官表达了EGFP基因,其中有2只鸡的性腺发生嵌合,表明利用赤道面开窗后对受体鸡进行胚下腔显微注射可以生产嵌合体鸡。; 张亚妮杨海燕施青青张振韬郑蒙蒙王丹李碧春; 关键词：鸡胚胎干细胞显微注射

猪精原干细胞体外分离培养及诱导分化的研究被引量：4: 2014年; 本研究旨在建立猪精原干细胞(Porcine spermatogonial stem cells,pSSCs)体外分离和诱导分化,并探索pSSCs定向分化及分化过程中关键基因的表达情况。采用差速贴壁法分离pSSCs和支持细胞(Sertoli),采用生化和免疫学方法鉴定其干细胞特性;传至3代后通过添加不同诱导剂,诱导SSCs向脂肪细胞、神经元样细胞和成骨细胞分化,并通过生化染色、qRT-PCR和免疫细胞化学检测诱导效果。结果表明:分离得到的pSSCs在饲养层上生长良好,碱性磷酸酶(AKP)及SOX2、integrinα6、SSEA1、Dazl抗体鉴定均呈阳性,表明SSCs处在未分化状态。诱导8d后,甲苯胺蓝染色及NSE抗体鉴定成阳性,成功诱导SSCs为神经元样细胞;诱导16d后,ALP、Von Kossa染色及Collagon l抗体鉴定均呈阳性,诱导SSCs为成骨细胞;诱导22d后,油红O染色可见脂滴被染成红色,诱导SSCs成为脂肪细胞。在SSCs诱导过程中,qRT-PCR结果显示,Nestin和β-tubulin在6d左右表达量最高,Cbfα1和Osterix在12d左右表达量最高,PPARγ和C/EBPα在18d左右表达量最高。本研究成功分离获得pSSCs,并且pSSCs可分别定向诱导分化为成骨细胞、神经元样细胞和脂肪细胞,表达细胞特有标记基因。; 陈庭锋王霄燕李东施青青张蕾邱峰龙刘志永庄勋卞桂华宋成义李碧春; 关键词：精原干细胞体外培养诱导分化基因表达

鸡生殖干细胞研究现状与展望被引量：1: 2011年; 鸡生殖干细胞是一类多能性干细胞,既可以在体外进行长期的自我更新,又能保持多向分化潜能,在禽类胚胎发育研究、转基因禽类生产及家禽育种等方面均有巨大应用价值。本文主要就鸡生殖干细胞的分离、培养与鉴定方法的研究进展及其应用前景进行简要综述,为进一步发展更高效的鸡生殖干细胞培养体系并应用于生产实践提供一定的借鉴。; 李碧春施青青孙敏; 关键词：生殖干细胞原始生殖细胞精原干细胞

卵泡刺激素诱导鸡胚胎干细胞向雄性生殖细胞分化的研究被引量：4: 2014年; 文章探讨了卵泡刺激素(FSH)诱导鸡胚胎干细胞(ESCs)向雄性生殖细胞分化的作用效果。首先对FSH的适宜诱导浓度进行筛选,再将传至2代的ESCs,在RA和支持细胞诱导的基础上添加适宜浓度的FSH进行诱导,通过形态学观察、实时荧光定量PCR及免疫细胞化学对诱导结果进行检测。筛选出适宜的FSH浓度为25 ng/mL。单独使用FSH诱导,未出现类SSCs样细胞;FSH与支持细胞诱导至第6天出现类胚体,至第12天,出现少量精原样细胞;FSH联合支持细胞和维甲酸(RA)进行诱导,至第2天出现类胚体,第12天出现类SSC样细胞。实时荧光定量PCR结果显示,FSH+支持细胞组、FSH+支持细胞+RA组中,Stra8、integrinβ1、Dazl表达量都持续上调,ESCs标记基因Nanog、Sox2表达量均呈持续下调趋势。添加FSH的诱导组中Stra8的表达量相对于各对照组上调显著。FSH单独诱导不能引起ESCs向雄性生殖细胞分化,但具有促进支持细胞和RA诱导ESCs向雄性生殖细胞分化的作用效果,该结果为进一步研究雄性生殖细胞的形成和调控机制提供理论基础。; 蒋一秀许厚强左其生张蕾李东施青青张亚妮李碧春; 关键词：鸡胚胎干细胞雄性生殖细胞分化卵泡刺激素

TGFβ信号通路对鸡胚胎干细胞向雄性生殖细胞分化的作用研究: 前言生殖细胞在有性繁殖的生物中肩负着将遗传信息在世代中传递的任务，并能代替胚胎干细胞(ESCs)用于治疗和遗传修饰，而不涉及伦理和免疫排斥问题。但是，如何在体外培养条件下获得大量的精原干细胞(SSCs)并使其能够产生具有...; 张亚妮施青青王颖洁左其生李东连超毕瑜林王飞纪艳芹路镇宇李碧春; 关键词：鸡胚胎干细胞雄性生殖细胞分化

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