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王丹: 作品数：11 被引量：23H指数：3; 供职机构：扬州大学动物科学与技术学院更多>>; 发文基金：国家自然科学基金国家教育部博士点基金江苏省高校自然科学研究项目更多>>; 相关领域：农业科学生物学更多>>

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山羊骨骼肌卫星细胞系分离、培养及其成肌诱导分化研究被引量：3: 2013年; 采用外科手术方法从山羊四肢肌肉或背最长肌获取3mm×3mm肌肉束,置于1mg.mL-1 IV胶原酶中,室温消化30min,分散肌丝,在体视显微镜下分离肌丝;再用0.25%胰酶-EDTA于37℃下消化10min,以释放出骨骼肌卫星细胞(SSC)和其他细胞。连续5代在增殖培养体系(80%DMEM/F12+10%胎牛血清+10%马血清)中采用差速贴壁方法,收集接种后20min的贴壁细胞,对纯化的SSC采用免疫荧光方法检测SSC特异标志蛋白Pax-7,结果表明:(92.5±3.4)%细胞表达Pax-7,(93.0±1.8)%细胞表达MyoD,说明90%以上细胞为SSC。将纯化的SSC细胞分别在诱导培养体系Ⅰ(93%DMEM/F12+1%胎牛血清+1%马血清+1%non-AA)和II(99%Opti-MEM+1%non-AA)中进行诱导培养,通过细胞形态学观察和成肌细胞早期标志蛋白Desmin、MyHC免疫荧光检测诱导效果,结果表明:采用体系Ⅱ能在各种细胞密度(大于1×105个.cm-2)下诱导山羊SSC向成肌方向分化,而采用体系Ⅰ(低血清培养基)且仅当能诱导高密度山羊SSC向成肌方向分化。采用改进的SSC分离方法能够获得较高纯度的卫星细胞,比较诱导体系Ⅰ、Ⅱ认为,诱导培养体系Ⅱ适合于山羊SSC成肌诱导分化,为进一步研究SSC成肌分化机制提供素材。; 李伟郑蒙蒙邱峰龙朱才业韦光辉王丹李碧春; 关键词：山羊骨骼肌卫星细胞细胞培养

鸡胚胎干细胞的分离及其嵌合体制备条件探索被引量：2: 2012年; 分离培养鸡胚胎干细胞(ESCs),体外培养传代后,进行碱性磷酸酶活性检测和SSEA-1染色鉴定;并用线性化的质粒pEGFP-N1转染鸡ESCs。受体种蛋经赤道面开窗后,将经转染的ESCs注射到受体鸡胚胚下腔,以便制作嵌合体鸡;对获得的嵌合体鸡分别提取血液和组织DNA后进行PCR检测。结果表明:5只存活的的嵌合体鸡血液中没有发生EGFP基因嵌合,但有4只嵌合体鸡的部分器官表达了EGFP基因,其中有2只鸡的性腺发生嵌合,表明利用赤道面开窗后对受体鸡进行胚下腔显微注射可以生产嵌合体鸡。; 张亚妮杨海燕施青青张振韬郑蒙蒙王丹李碧春; 关键词：鸡胚胎干细胞显微注射

鸡Dazl基因的克隆及其亚细胞定位研究被引量：2: 2013年; 为克隆鸡Daz(lDeleted in azoospermia-like,Dazl)基因CDS序列,通过构建eGFP标记的DAZL真核表达载体,实现该基因产物的亚细胞定位以探究其生物信息学功能。提取1日龄鸡睾丸总RNA,通过巢式PCR方法扩增出Dazl基因的CDS,构建真核表达载体pEGFP-C1-DAZL。采用LipofectaminTMLTX介导重组表达载体pEGFP-C1-DAZL转染CEF细胞,48h后于荧光倒置显微镜下观察其表达定位,同时利用RT-PCR和Western-blot进一步鉴定eGFP-Dazl和蛋白水平的表达情况。结果表明:克隆出Dazl基因的完整CDS,长度870bp,共编码289个氨基酸,与公布的鸡Dazl基因(GenBank登陆号:NM_204218)CDS区同源性达99%,编码氨基酸完全一致。酶切鉴定和序列分析均表明真核表达载体pEGFP-C1-DAZL构建成功。转染48h后,RT-PCR和Western-blot分别检测到949bp特异条带和59.7ku的融合蛋白。荧光显微镜观察显示,融合蛋白(eGFP-Dazl)主要分布于细胞核。; 郑蒙蒙李伟施青青王丹黄晓梅李碧春; 关键词：DAZL 真核表达载体绿色荧光蛋白亚细胞定位

BMP4诱导鸡胚胎干细胞向雄性生殖细胞分化的研究被引量：7: 2013年; 旨在探讨BMP4诱导鸡胚胎干细胞向雄性生殖细胞分化的作用机理。采用单层贴壁培养作为分化模式，分别采用10、20、30和40ng·mL-1 BMP4浓度诱导雄性鸡胚胎干细胞，通过形态学、荧光定量PCR和免疫细胞化学检测诱导效果。根据细胞形态变化和差异基因表达量变化，确定了BMP4的适宜诱导浓度为40ng·mL-1。在适宜浓度诱导过程中，诱导4d类胚体开始出现，6～8d类胚体逐渐增大，数量增多，10d部分类胚体开始散开，变为小的圆形细胞，12d在散开后的类胚体周围可观察到少量生殖样细胞，14d生殖样细胞数目增多，且呈聚团生长的趋势。诱导过程中相应基因表达量也发生变化：胚胎干细胞标记基因Nanog、Sox2表达量显著下降（P〈O．01），生殖细胞特异基因Stra8、Dazl、integrina6、c-kit表达量均呈显著上升趋势（P〈O．01）。BMP4可以引起生殖细胞相应基因的表达，促进雄性鸡胚胎干细胞向雄性生殖细胞方向分化，结果为雄性生殖细胞的体外诱导研究提供试验参考，为进一步研究雄性生殖细胞发生和调控机制提供理论基础。; 施青青张振韬李鹏程郑蒙蒙王丹黄晓梅张亚妮李碧春; 关键词：鸡胚胎干细胞雄性生殖细胞分化 BMP4

神经氨酸酶基因联合抗黏液病毒基因的抗病毒作用被引量：1: 2013年; 拟构建神经氨酸酶(NA)基因和抗黏液病毒(Mx)基因双基因真核共表达载体,并检测基因表达以及转染鸡成纤维(CEF)细胞后的抗病毒效果。克隆了NA基因和突变型Mx基因的cDNA;分别定向插入真核细胞双顺反子载体pVITRO2中,酶切和测序鉴定双基因共表达载体pVITRO2-Mx-NA的正确性。用pVITRO2-Mx-NA转染NIH-3T3细胞,通过RT-PCR和间接免疫荧光(IFA)方法检测目的基因的表达。随后用pVITRO2-Mx-NA转染CEF细胞,利用RT-PCR及微量细胞病变抑制法测定重组蛋白抗新城疫病毒(NDV)的效果。结果:酶切和测序分析表明成功构建了双基因真核共表达载体pVITRO2-Mx-NA,在转染后的NIH-3T3和CEF细胞中同时检测到了NA和Mx基因的表达。联合基因表达的重组蛋白可保护CEF细胞在孵育的72h内免受NDV的感染,而转染了突变型Mx或者NA单基因真核表达载体的CEF细胞在孵育的48h内亦未受到NDV的侵染;与单基因转染组相比,联合基因转染组明显延迟NDV感染CEF细胞的时间,差异显著(P<0.05)。构建的双基因真核表达载体pVITRO2-Mx-NA转染CEF细胞后,其表达的重组蛋白Mx-NA在细胞水平上具有协同延缓NDV感染的能力,且优于单个基因。; 傅德智张亚妮陈昊李伟郑蒙蒙王丹张振韬施青青李碧春; 关键词：MX 抗NDV

徐淮山羊SCD1基因的克隆和亚细胞定位研究及转基因小鼠的制备被引量：1: 2013年; 【目的】克隆徐淮山羊硬脂酰辅酶A脱氢酶1(SCD1)基因的cDNA并分析该基因生物信息学功能。通过EGFP融合蛋白在亚细胞水平定位该基因表达产物,研究该基因在异种动物体内表达情况,探索制备异种转基因动物的可能性及外源基因能否稳定遗传。【方法】采用RT-PCR方法从徐淮山羊脂肪组织中克隆SCD1基因cDNA,进行生物信息学分析,并构建含有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的融合表达载体pEGFP-C1-SCD1,脂质体(LTX)介导基因转染NHI-3T3细胞,48 h后荧光倒置显微镜下观察基因表达产物的分布,RT-PCR检测mRNA在体外水平的表达。利用睾丸注射法制备转基因小鼠,在F1代和F2代个体DNA水平和蛋白水平上检测目的基因的表达情况。【结果】成功克隆出徐淮山羊SCD1基因的全序列cDNA,大小为1 074 bp,编码357个氨基酸,GenBank登录号为JX854036,徐淮山羊SCD1序列与人、褐家鼠、小家鼠、绵羊、牛和野猪相应编码区的同源性分别为86%、83%、82%、98%、95%、90%,氨基酸序列同源性分别为84%、79%、79%、96%、92%、95%;成功构建了融合表达载体pEGFP-C1-SCD1;RT-PCR检测mRNA表达明显;EGFP-SCD1融合蛋白定位在NIT-3T3细胞质中,与在线软件预测一致;通过尾静脉注射和睾丸注射,该基因可以在小鼠体内暂态表达和持续性表达,且可以稳定遗传。【结论】体外克隆的徐淮山羊SCD1基因cDNA在单细胞水平上表达于细胞质中,在小鼠体内也可以表达。; 朱才业韦光辉李伟王丹郑蒙蒙刘志永张亚妮李碧春; 关键词：徐淮山羊荧光蛋白转基因鼠

视黄酸及Stra8基因联合作用对雄性鸡胚胎干细胞分化的影响被引量：3: 2014年; 旨在研究视黄酸(All-trans retinoic acid,RA)及Stra8(Stimulated by retinoic acid gene 8)基因联合作用对雄性鸡胚胎干细胞(Chicken embryonic stem cells,cESCs)分化的影响。选用PCR方法鉴定雄性cESCs为研究对象,转染Stra 8基因,对Stra8基因阳性cESCs使用RA进行12d连续诱导,同时设立Stra8基因转染组、RA诱导组及空白组对照,各组均进行3次重复试验。细胞形态学、qRT-PCR检测RA及Sira8基因对cESCs分化的影响。结果表明。转染Stra8基因进行RA诱导,在诱导12d后,出现精原干细胞样的圆形小克隆,其他组cESCs出现类胚体或解体;qRT-PCR鉴定发现各组中干细胞标记基因表达量随着培养时间的延长逐渐下降,同时检测到生殖细胞相关基因表达,转染Stra8基因并使用RA诱导组中表达量均高于对照组(P<0.01),6d表达量达到最高,然后逐渐下降。Stra8基因和RA的联合作用能够促进cESCs向着生殖细胞方向的分化,不仅改变了原有细胞形态,同时出现了生殖相关基因的表达。通过该方法可以在体外建立一个。ESCs诱导分化模型,将为生殖细胞的发生、增殖、分化及调控机理的研究和人类不孕不育症的治疗奠定良好的基础。; 张振韬王丹施青青ELSAYED A K张亚妮韦光辉朱睿左其生李东刘堃李碧春; 关键词：RA 分化基因表达

鸡胚原始生殖细胞生物学特性鉴定及相关基因表达研究被引量：2: 2012年; 采用酶消化法分离鸡胚原始生殖细胞(PGCs),纯化后进行体外培养,传至5～6代时,通过对阶段特异性胚胎抗原-1(SSEA-1)免疫荧光标记、碱性磷酸酶检测等方法联合鉴定其基本生物学特性,同时以RT-PCR方法检测其特异基因的表达。结果表明:体外培养的PGCs维持未分化状态,碱性磷酸酶阳性、免疫荧光检测其特异标志物SSEA-1阳性。鸡胚PGCs表达减数分裂前标志基因Dazl、Nanog和GDF3,生殖细胞分化后期基因CVH,原始生殖细胞标志基因Blimp-1以及干细胞多能性相关基因Oct-4,不表达减数分裂启动基因Stra8。提示所获得的鸡胚PGCs,其生物学特性稳定,表达相关特异基因,为鸡胚PGCs的体外培养及鉴定提供理论依据。; 施青青孙敏郑蒙蒙王丹黄晓梅张亚妮李碧春; 关键词：体外培养生物学特性

睾丸体内介导制备抗病转基因鸡的研究: 精原干细胞(SSCs)是动物睾丸内具有高度自我更新能力和分化潜能的细胞，能向子代传递遗传信息。通过此方法，Kalina、He、Li等已成功获得含有绿色荧光蛋白的转基因鼠和转基因鸡，Honaramooz在山羊上也获得了成功...; 孙敏施青青王丹郑蒙蒙李碧春; 关键词：精原干细胞转基因鸡

鸡Stra8基因真核表达载体构建及亚细胞定位的研究被引量：2: 2013年; 试验旨在克隆苏禽黄鸡视黄酸激活基因8(Stra8)的cDNA序列,构建pEGFP-C1-Stra8载体并制备鸡Stra8抗体。通过RT-PCR克隆苏禽黄鸡Stra8基因cDNA,构建pEGFP-C1-Stra8和pcDNA3.1(+)-Stra8重组质粒,分别转染NIH-3T3细胞和免疫小鼠制备抗体,间接免疫荧光法检测抗体效价以及在细胞中的分布。结果显示,苏禽黄鸡Stra8基因cDNA全长645bp,共编码214个氨基酸,提交至GenBank获得登录号为JX204292.1;成功制备Stra8多克隆抗体,pEGFP-C1-Stra8融合蛋白在NIH-3T3细胞质中表达。该结果为深入探讨禽类Stra8生物学功能奠定了基础。; 王丹张振韬施青青黄晓梅朱才业郑蒙蒙李伟徐剑蓉王克华李碧春; 关键词：多克隆抗体亚细胞定位

王丹

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