潘海龙
- 作品数：20 被引量：23H指数：3
- 供职机构：成都生物制品研究所有限责任公司更多>>
- 发文基金：国家科技重大专项国家科技支撑计划更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学农业科学更多>>
- 牛血清中牛病毒直接免疫荧光检测方法的建立及验证
- 2014年
- 目的建立牛血清中牛病毒直接免疫荧光检测方法,并进行验证。方法建立直接免疫荧光法检测牛血清中牛病毒,对细胞接种浓度和血清浓度、病毒接种量、荧光抗体浓度、染色温度及时间进行优化;对优化的方法进行重复性、特异性、灵敏度验证,并与细胞培养法的检测结果进行比较。结果优化的试验条件为：Vero和BT细胞的接种浓度分别为0.5×105和1.0×105个/ml,血清浓度为5%,病毒接种量为100~300 CCID50,荧光抗体1∶10稀释,4℃染色12 h以上,但不超过24 h。2名实验人员按建立的方对3批牛血清分别进行3次检测,均未检出6种牛病毒;每种病毒仅在相应抗体进行染色时出现荧光;该方法检测6种牛病毒的灵敏度较高。分别采用细胞培养法和直接免疫荧光法检测15批新生牛血清和5批胎牛血清,结果均未检出牛病毒。结论建立的牛血清中牛病毒直接免疫荧光检测方法重复性好,特异性强,灵敏度高,操作简便,与细胞培养法的检测结果无差异,可应用于牛血清中牛病毒的检测。
- 袁良玉黄敏潘海龙吕冰凌王静谭昌耀朱文
- 关键词：牛血清直接免疫荧光法
- 顶空气相色谱法测定A群脑膜炎球菌结合疫苗原液中乙腈及三乙胺的残留量被引量：5
- 2016年
- 目的建立A群脑膜炎球菌结合疫苗原液中乙腈及三乙胺残留量的顶空气相色谱测定法,并进行验证。方法采用标准溶液加入法,以10%无水碳酸钠溶液为溶剂制备混合对照品及供试品溶液,采用顶空气相色谱法进行检测,色谱条件为：采用Agilent DB-1毛细管柱（30 m×0.53 mm×5.0μm）;柱流速：4 ml/min;载气：氮气,分流比：10：1;程序升温：柱温起始温度为40℃,保持5 min,以10℃/min的升温速率升至200℃,保持2 min;进样口温度：200℃;FID检测器温度：250℃;顶空瓶平衡温度：80℃,平衡时间30 min。对方法的系统适应性、线性范围、重复性、检测限和定量限、准确性进行验证。采用建立的方法检测4批A群脑膜炎球菌结合疫苗原液的乙腈及三乙胺残留量。结果各待测组分理论塔板数不低于5 000,分离度不低于1.5;乙腈和三乙胺的线性方程分别为y=3 730.2 x＋1.210 6和y=64 699 x＋11.772,r均为0.999 9,线性范围分别为2.002~100.1μg/ml和1.508~75.40μg/ml;同一混合对照品溶液重复检测5次乙腈和三乙胺残留量的RSD值分别为1.34%和3.10%;乙腈和三乙胺检测限分别为0.020 02和0.007 54μg/ml,定量限分别为0.066 72和0.030 16μg/ml;样品高、中、低3个浓度的乙腈和三乙胺平均加样回收率分别为102.60%和101.92%,RSD分别为1.76%和4.12%。4批A群脑膜炎球菌结合疫苗原液中均未检出乙腈及三乙胺。结论该方法具有良好的重复性、准确性,可用于A群脑膜炎球菌结合疫苗原液中乙腈及三乙胺残留量的检测。
- 赵荣丽刘峰薛千成潘海龙吕雪艳熊慧玲
- 关键词：乙腈三乙胺残留量
- 用于卡介菌多糖核酸制剂效力实验的小鼠模型的建立
- 2012年
- 目的建立用于卡介菌多糖核酸制剂效力实验的小鼠模型。方法选用猪血清、牛血清白蛋白、卵白蛋白作为致敏原，腹腔注射BALB／c小鼠以建立I型变态反应动物模型，并通过在卡介菌多糖核酸制剂效力实验中应用建立的小鼠模型来验证其可行性。采用t检验对测定结果进行统计学分析。结果猪血清、牛血清白蛋白和卵白蛋白均可作为致敏原致敏BALB／c小鼠，但牛血清白蛋白和卵白蛋白的致敏效果优于猪血清。卡介菌多糖核酸制剂效力实验显示，牛血清白蛋白实验组与对照组间的小鼠发病分值差异具有统计学意义（t=3．22，P=0．0045），表明牛血清白蛋白致敏小鼠建立的动物模型可更好地反映卡介菌多糖核酸制剂的效力。结论牛血清白蛋白致敏小鼠建立的动物模型可用于卡介菌多糖核酸制剂效力实验。
- 徐永革秦黎静王玉英唐溯潘海龙王静刘菊
- 关键词：白蛋白类抗变态反应药卡介菌多糖核酸
- 生物制品实验室间检测结果对比分析在批签发管理中的应用被引量：3
- 2014年
- 生物制品实验室间检测结果的对比分析是指应用统计学的方法对国家质量控制实验室(NCL)与企业质量控制实验室检测的制品的重要质量控制数据进行比较。该分析可以有效地保证产品质量的一致性,比较检测过程是否有效运行,确定影响合格/不合格判定的潜在因素,在批签发管理中具有重要的作用。WHO明确要求NCL应对产品的关键质量参数进行实验室间检测结果的对比分析,对于系统差异应记录,对于不符合和趋势偏差较大的应进行分析调查,查找引起偏差的原因,制订纠正和预防措施。
- 马霄张华捷侯文婷潘海龙谭亚军
- 关键词：批签发
- 乙型脑炎减毒活疫苗中猪圆环病毒PCR检测方法的建立及验证被引量：4
- 2016年
- 目的建立乙型脑炎减毒活疫苗中猪圆环病毒1型(porcine circovirus 1,PCV1)和猪圆环病毒2型(PCV2)PCR检测方法,并进行验证及初步应用。方法参照Gen Bank中登录的PCV1(AY193712)及PCV2序列(AY181946)设计引物,以提取的PCV1和PCV2基因组DNA为模板,分别经PCR扩增726 bp的PCV1片段和433 bp的PCV2片段,并对PCR反应中的退火温度、引物浓度、Mg2+浓度参数进行优化。将PCR扩增产物分别与p MD18-T载体连接,连接产物转化感受态大肠埃希菌DH5α,挑取阳性克隆,测序并进行同源性分析。对优化的PCR方法进行灵敏度和特异性验证,并用该方法检测3批乙型脑炎减毒活疫苗工作种子批、4批明胶和10批胰蛋白酶中的PCV1和PCV2。结果确定PCR反应的退火温度为54℃,引物浓度为10μmol/L,Mg2+浓度为10 mmol∕L。扩增的目的基因测序结果与Gen Bank中发布的PCV1及PCV2序列的同源性均为100%。建立的PCR方法最低可检出10 pg的目的基因;该方法只对PCV1和PCV2基因组DNA能扩增出特异性条带。用该方法检测乙型脑炎减毒活疫苗工作种子批、明胶和胰蛋白酶,均未检出PCV1和PCV2。结论成功建立了乙型脑炎减毒活疫苗中PCV1和PCV2的PCR检测方法,该方法具有较高的灵敏度和较强的特异性,可用于乙型脑炎减毒活疫苗工作种子批及两种猪源性原材料的PCV1和PCV2污染检测。
- 黄敏吕冰凌袁良玉易维维吴朔华曲芙莲潘海龙
- 关键词：乙型脑炎减毒活疫苗猪圆环病毒1型猪圆环病毒2型
- 1例BHK21工作细胞库升级为主细胞库的变更管理被引量：1
- 2017年
- 目的执行变更控制管理程序规定,将数量少的BHK21工作细胞库升级为主细胞库,将主细胞库传代扩增成新的、数量较多的工作细胞即建立新的工作细胞库。方法菌毒种细胞管理部门质量检定室(QC)提出变更申请,质量营运部(QCM)召集质量符合性讨论会(QCF)对变更申请进行评估,将该变更分类确认为主要变更,制定变更实施计划、审核、批准,QC按照评估意见逐步实施并形成完善记录,QCF对变更实施结果进行评估,并决定同意变更有效并关闭。结果按照变更控制流程逐步完成各项计划步骤,根据《中国药典》(2010年版三部)检定用细胞的规定要求,对现用BHK21工作细胞库及新建工作细胞库施行细胞鉴别试验、无菌检查、支原体检查、外源病毒污染检查以及病毒敏感性检查,所有项目检定结果符合规定,QC签发检定报告,质量保证部(QA)审核签发合格报告。结论此例BHK21工作细胞库升级为主细胞的变更行动已完成,变更实施达到QCF变更申请评估要求,现用BHK21工作细胞库可升级为主细胞库,新建BHK21工作细胞库可用于乙脑减毒活疫苗(乙脑疫苗)和乙脑病毒SA14-14-2减毒株即乙脑疫苗生产用毒种的质量检定。
- 王红许敬敏罗珊吕冰凌杨锣彭维潘海龙
- 关键词：变更管理
- 乙脑病毒SA14-14-2减毒株分枝杆菌检测分析
- 2016年
- 目的对乙脑减毒活疫苗生产用毒种即乙脑病毒SA14-14-2减毒株的现行主种子批、工作种子批进行分枝杆菌检测,更好地控制外源因子对乙脑减毒活疫苗生产用毒种的污染。方法运用改良罗氏培养基培养法对乙脑病毒SA14-14-2减毒株的4个批号毒种样本进行分枝杆菌检测。结果 4个批号的乙脑病毒SA14-14-2减毒株毒种样本(主种子批,批号:9903;工作种子批,批号:JEV-W-7-20120701、JEV-W-7-20120702及JEV-W-7-20131201)的分枝杆菌培养结果无菌落生长。结论本次试验中4个批号的乙脑病毒SA14-14-2减毒株毒种样本分枝杆菌培养检测为阴性,说明乙脑毒种样本没有受到分枝杆菌污染,进而保障了乙脑减毒活疫苗的安全性。
- 王红龙波杨筠吕冰凌唐溯潘海龙
- 关键词：乙脑减毒活疫苗
- 乙型脑炎减毒活疫苗生产株SA14-14-2全基因组序列测定及基因遗传稳定性
- 2017年
- 目的对乙型脑炎减毒活疫苗生产株SA14-14-2株进行全基因组序列测定和分析,并观察该生产株在疫苗制备过程中的基因遗传稳定性。方法根据DNA序列数据库(Gen Bank)公布的SA14-14-2株的序列,设计合成7对引物,提取疫苗生产株SA14-14-2及其工作种子批生产的3批原液、3批成品疫苗的病毒RNA,通过RT-PCR方法扩增SA14-14-2株的cDNA片段,分别克隆到pGEM-T载体,转化至大肠埃希菌DH5α中,挑取阳性菌落克隆、鉴定后测定全序列并对序列进行比较分析,观察毒株在传代的过程中病毒滴度的稳定性。结果乙型脑炎减毒活疫苗生产株SA14-14-2株基因组全长10 976 bp,编码3 433个氨基酸。3批原液和3批成品疫苗的基因组全长为10 977 bp,比较分析发现,在3'端非编码区10 701处多一个G核苷酸的插入。与DNA序列数据库(Genbank)登录号为D90195的全长序列同源性分别是99.9%、99.9%、99.9%、99.9%、99.8%、99.9%、99.8%,其中E蛋白的同源性均为100%。SA14-14-2生产株的病毒滴度为7.22 lg PFU/mL,原液和成品疫苗的滴度分别为7.32、7.23、7.32、6.86、6.92、6.70 lg PFU/mL。结论乙型脑炎减毒活疫苗生产株SA14-14-2基因稳定,具有良好的一致性,为乙型脑炎减毒活疫苗的质量的稳定性提供了可靠依据。
- 黄敏袁良玉吕冰凌潘海龙卓金蓉
- 关键词：乙型脑炎减毒活疫苗SA14-14-2株全基因组序列E蛋白
- 分析仪器确认规范在实时荧光定量PCR仪确认中的实施
- 2015年
- 目的 通过对实时荧光定量PCR（real-time fluorescent quantitative PCR,RTFQ-PCR）仪实施确认,了解分析仪器确认的具体步骤.方法 根据药品生产质量管理规范的要求,对该RTFQ-PCR仪分别进行安装确认、运行确认和性能确认,以及年度再确认.在性能确认中,通过定量PCR法和环介导恒温（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）法检测分枝杆菌核酸来验证该仪器的准确性和重复性.结果 RTFQ-PCR仪的安装符合要求,各项测试操作均达到规定的标准.当采用定量PCR法检测TB进行RTFQ-PCR仪性能确认时,结核杆菌（tubercle bacillus,TB）核酸浓度的对数与循环阈值（cycle threshold,Ct）之间呈现良好的线性关系,相关系数绝对值达0.999 9;TB核酸回收率为97％～105％;对2个TB样品分别进行3次检测获得的Ct值的变异系数（C聊均小于5％.当采用LAMP法检测分枝杆菌进行RTFQ-PCR仪性能确认和再确认时,对分枝杆菌阳性对照和样品分别进行3次检测获得的Ct值的CV均小于5％.结论 该RTFQ-PCR仪得到成功确认,各方面均符合规定的要求.
- 许敬敏吕冰凌刘菊潘海龙
- 关键词：聚合酶链反应药品生产质量管理规范
- 不同细胞进行牛血清中牛源病毒检测的比较试验
- 2014年
- 对不同细胞进行牛血清中牛源病毒检测的比较实验,选出用于牛血清中病毒检测的最适合外源病毒增殖的细胞,从而提高血清中病毒的检出率,以确保用于疫苗生产的牛血清安全可靠。将牛腹泻病毒、牛腺病毒、牛细小病毒、牛副流感病毒、呼肠孤病毒和狂犬病毒接种到培养好的MDBK细胞、VERO细胞、BT细胞中,逐日观察细胞的病变情况,待观察到10%细胞出现病变或者培养7 d后,进行免疫荧光染色,选出适合用于六种病毒增殖的细胞系。结果显示,BT细胞对所有病毒敏感,VERO细胞对BAV、BVDV病毒不敏感,MDBK对REO、BVDV、RV三种病毒不敏感。综合比较后,选择BT细胞为BPIV、BPV、BAV、BVDV的增殖及实验用细胞,VERO细胞为REO、RV的增殖及实验用细胞。
- 袁良玉黄敏户美玲吕冰凌潘海龙孟丽
- 关键词：细胞病毒增殖
