黄敏
- 作品数：5 被引量：4H指数：1
- 供职机构：成都生物制品研究所有限责任公司更多>>
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- 相关领域：医药卫生农业科学更多>>
- 牛血清中牛病毒直接免疫荧光检测方法的建立及验证
- 2014年
- 目的建立牛血清中牛病毒直接免疫荧光检测方法,并进行验证。方法建立直接免疫荧光法检测牛血清中牛病毒,对细胞接种浓度和血清浓度、病毒接种量、荧光抗体浓度、染色温度及时间进行优化;对优化的方法进行重复性、特异性、灵敏度验证,并与细胞培养法的检测结果进行比较。结果优化的试验条件为：Vero和BT细胞的接种浓度分别为0.5×105和1.0×105个/ml,血清浓度为5%,病毒接种量为100~300 CCID50,荧光抗体1∶10稀释,4℃染色12 h以上,但不超过24 h。2名实验人员按建立的方对3批牛血清分别进行3次检测,均未检出6种牛病毒;每种病毒仅在相应抗体进行染色时出现荧光;该方法检测6种牛病毒的灵敏度较高。分别采用细胞培养法和直接免疫荧光法检测15批新生牛血清和5批胎牛血清,结果均未检出牛病毒。结论建立的牛血清中牛病毒直接免疫荧光检测方法重复性好,特异性强,灵敏度高,操作简便,与细胞培养法的检测结果无差异,可应用于牛血清中牛病毒的检测。
- 袁良玉黄敏潘海龙吕冰凌王静谭昌耀朱文
- 关键词：牛血清直接免疫荧光法
- 不同细胞进行牛血清中牛源病毒检测的比较试验
- 2014年
- 对不同细胞进行牛血清中牛源病毒检测的比较实验,选出用于牛血清中病毒检测的最适合外源病毒增殖的细胞,从而提高血清中病毒的检出率,以确保用于疫苗生产的牛血清安全可靠。将牛腹泻病毒、牛腺病毒、牛细小病毒、牛副流感病毒、呼肠孤病毒和狂犬病毒接种到培养好的MDBK细胞、VERO细胞、BT细胞中,逐日观察细胞的病变情况,待观察到10%细胞出现病变或者培养7 d后,进行免疫荧光染色,选出适合用于六种病毒增殖的细胞系。结果显示,BT细胞对所有病毒敏感,VERO细胞对BAV、BVDV病毒不敏感,MDBK对REO、BVDV、RV三种病毒不敏感。综合比较后,选择BT细胞为BPIV、BPV、BAV、BVDV的增殖及实验用细胞,VERO细胞为REO、RV的增殖及实验用细胞。
- 袁良玉黄敏户美玲吕冰凌潘海龙孟丽
- 关键词：细胞病毒增殖
- 乙型脑炎减毒活疫苗生产株SA14-14-2全基因组序列测定及基因遗传稳定性
- 2017年
- 目的对乙型脑炎减毒活疫苗生产株SA14-14-2株进行全基因组序列测定和分析,并观察该生产株在疫苗制备过程中的基因遗传稳定性。方法根据DNA序列数据库(Gen Bank)公布的SA14-14-2株的序列,设计合成7对引物,提取疫苗生产株SA14-14-2及其工作种子批生产的3批原液、3批成品疫苗的病毒RNA,通过RT-PCR方法扩增SA14-14-2株的cDNA片段,分别克隆到pGEM-T载体,转化至大肠埃希菌DH5α中,挑取阳性菌落克隆、鉴定后测定全序列并对序列进行比较分析,观察毒株在传代的过程中病毒滴度的稳定性。结果乙型脑炎减毒活疫苗生产株SA14-14-2株基因组全长10 976 bp,编码3 433个氨基酸。3批原液和3批成品疫苗的基因组全长为10 977 bp,比较分析发现,在3'端非编码区10 701处多一个G核苷酸的插入。与DNA序列数据库(Genbank)登录号为D90195的全长序列同源性分别是99.9%、99.9%、99.9%、99.9%、99.8%、99.9%、99.8%,其中E蛋白的同源性均为100%。SA14-14-2生产株的病毒滴度为7.22 lg PFU/mL,原液和成品疫苗的滴度分别为7.32、7.23、7.32、6.86、6.92、6.70 lg PFU/mL。结论乙型脑炎减毒活疫苗生产株SA14-14-2基因稳定,具有良好的一致性,为乙型脑炎减毒活疫苗的质量的稳定性提供了可靠依据。
- 黄敏袁良玉吕冰凌潘海龙卓金蓉
- 关键词：乙型脑炎减毒活疫苗SA14-14-2株全基因组序列E蛋白
- 乙型脑炎减毒活疫苗中猪圆环病毒PCR检测方法的建立及验证被引量：4
- 2016年
- 目的建立乙型脑炎减毒活疫苗中猪圆环病毒1型(porcine circovirus 1,PCV1)和猪圆环病毒2型(PCV2)PCR检测方法,并进行验证及初步应用。方法参照Gen Bank中登录的PCV1(AY193712)及PCV2序列(AY181946)设计引物,以提取的PCV1和PCV2基因组DNA为模板,分别经PCR扩增726 bp的PCV1片段和433 bp的PCV2片段,并对PCR反应中的退火温度、引物浓度、Mg2+浓度参数进行优化。将PCR扩增产物分别与p MD18-T载体连接,连接产物转化感受态大肠埃希菌DH5α,挑取阳性克隆,测序并进行同源性分析。对优化的PCR方法进行灵敏度和特异性验证,并用该方法检测3批乙型脑炎减毒活疫苗工作种子批、4批明胶和10批胰蛋白酶中的PCV1和PCV2。结果确定PCR反应的退火温度为54℃,引物浓度为10μmol/L,Mg2+浓度为10 mmol∕L。扩增的目的基因测序结果与Gen Bank中发布的PCV1及PCV2序列的同源性均为100%。建立的PCR方法最低可检出10 pg的目的基因;该方法只对PCV1和PCV2基因组DNA能扩增出特异性条带。用该方法检测乙型脑炎减毒活疫苗工作种子批、明胶和胰蛋白酶,均未检出PCV1和PCV2。结论成功建立了乙型脑炎减毒活疫苗中PCV1和PCV2的PCR检测方法,该方法具有较高的灵敏度和较强的特异性,可用于乙型脑炎减毒活疫苗工作种子批及两种猪源性原材料的PCV1和PCV2污染检测。
- 黄敏吕冰凌袁良玉易维维吴朔华曲芙莲潘海龙
- 关键词：乙型脑炎减毒活疫苗猪圆环病毒1型猪圆环病毒2型
- 乙型脑炎减毒活疫苗外源病毒因子检查法阳性对照的选择
- 2016年
- 目的 选择合适的阳性对照供乙型脑炎（乙脑）减毒活疫苗外源病毒因子检查法（细胞培养法）使用.方法 细胞病变试验中,将乙脑病毒稀释成不同浓度,分别接种3种细胞,培养2～3 d,观察培养期末细胞病变.病变较典型时对应的病毒浓度即为本试验细胞病变阳性对照浓度.血吸附试验中,将植物血凝素经0.5％鸡、豚鼠红细胞悬液稀释成不同浓度,分别加入3种细胞中,置2～8℃或20～25℃0.5h,观察血吸附情况.血吸附较典型的植物血凝素浓度即为本试验血吸附阳性对照浓度.结果 乙脑病毒浓度为3～4 lg噬斑形成单位/ml时可引起20％～50％细胞病变,植物血凝素浓度为30～40 mg/L时可导致20％～50％细胞血吸附.结论 适当浓度的乙脑病毒和植物血凝素可作为外源病毒因子检查法的试验阳性对照.
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- 关键词：微生物污染阳性对照
