王慧娟
- 作品数：7 被引量：18H指数：3
- 供职机构：重庆医科大学附属第一医院更多>>
- 发文基金：国家临床重点专科建设项目重庆市自然科学基金国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 利奈唑胺耐药肠球菌耐药机制分析被引量：2
- 2013年
- 目的探讨利奈唑胺耐药肠球菌的相关耐药机制。方法对临床分离到的10株利奈唑胺耐药肠球菌,分别提取基因组DNA及质粒DNA,采用PCR技术分别扩增23S rRNA的V583区片段、编码核糖体蛋白的L3、L4基因片段及cfr基因片段。阳性扩增产物进行测序并与标准菌株ATCC 29212进行比对,分析有无突变点。结果 10株利奈唑胺耐药肠球菌均PCR扩增出V583区、L3、L4目的基因,测序未检测到23S rRNA的V583区域发生点突变G2576T以及L3、L4基因突变所引起氨基酸序列的改变。10株细菌均未检测到cfr基因。结论我院分离的肠球菌未发现利奈唑胺耐药机制G2576T突变,L3、L4基因突变导致氨基酸序列改变及多重耐药基因cfr基因的存在,推断利奈唑胺耐药肠球菌仍存在未知的耐药机制。
- 王立朋何云燕严立王慧娟梁树梅夏云
- 关键词：利奈唑胺肠球菌耐药
- 体外斑点杂交筛选靶向多重耐药鲍曼不动杆菌高效反义核酸序列实验研究
- 2014年
- 目的体外斑点杂交实验模拟体内环境验证计算机辅助软件设计的反义寡核苷酸序列的活性。方法采用计算机辅助软件对多重耐药鲍曼不动杆菌生长必须基因gyrA的mRNA进行二级结构分析计算,设计出10条反义寡核苷酸序列,合成探针与体外转录并用地高辛标记的gyrA mRNA进行斑点杂交,分别选择一条杂交信号最强和一条杂交信号弱的探针序列合成连接穿膜肽序列的肽-肽核酸,以不同浓度的肽-肽核酸处理鲍曼不动杆菌标准株ATCC19606和多重耐药株,测定经不同浓度PPNA处理的细菌光密度A600值并进行平板菌落计数,观察其对细菌生长的抑制作用。以20μmol/L杂交信号强的肽-肽核酸作用于铜绿假单胞菌,测细菌光密度A600值,观察其对细菌生长的抑制作用。结果杂交信号强的肽-肽核酸对多重耐药的鲍曼不动杆菌和ATCC19606均有明显的体外抗菌活性,其最低抑菌浓度分别为5与10μmol/L,10μmol/L浓度时对两种细菌均具有杀菌活性,而杂交信号弱的肽-肽核酸对细菌的生长无抑制作用,即使将其浓度增加到20μmol/L。杂交信号强的肽-肽核酸对铜绿假单胞菌无生长抑制作用。结论体外斑点杂交实验能够验证计算机软件预测设计的具有特异性的反义核酸的活性,为体外可靠、快速、高通量筛选高效反义序列提供了一种有效的方法,并且为筛选所有基因高效反义序列搭建了一个平台。
- 梁树梅何云燕夏云王慧娟王立朋
- 关键词：鲍曼不动杆菌GYRA斑点杂交反义寡核苷酸肽核酸
- 核酸序列依赖扩增联合分子信标对曲霉菌感染的检测效果被引量：4
- 2013年
- 目的建立快速、灵敏、特异的定量检测曲霉菌感染的诊断方法。方法以烟曲霉菌、黄曲霉菌及黑曲霉菌的孢子配制菌液,提取RNA后,采用核酸序列依赖扩增(nucleic acid sequence-based amplification,NASBA)联合分子信标(molecular beacon,MB)技术进行荧光检测,并对该方法进行灵敏度和特异性分析。结果扩增过程中累计荧光量达到设定的荧光阈值所需循环数与标本中霉菌孢子量的对数存在线性相关关系(y=-10.7x+81.6,r=0.988)。将含有梯度数量霉菌孢子的标本提取总RNA后进行检测,可建立相应标准曲线。该方法的灵敏度可达到1个孢子;对照菌株(金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌、热带念珠菌、新型隐球菌)与曲霉菌提取总RNA经扩增后的产物进行电泳分析,发现仅曲霉菌出现特异性条带。结论 NASBA结合分子信标检测曲霉菌具有灵敏度高、特异性强的特点,具有潜在利用价值,有望成为曲霉菌感染的临床诊断方法。
- 王立朋何云燕夏云王慧娟
- 关键词：分子信标曲霉菌
- 多重耐药鲍曼不动杆菌gyrA基因高效反义肽核酸序列筛选及其体外抗菌活性观察被引量：4
- 2013年
- 目的筛选出能与多重耐药鲍曼不动杆菌gyrA基因的mRNA紧密结合的反义肽核酸序列,评估其体外抗菌活性。方法利用Mfold、RNA Structure 4.6两种计算机软件对多重耐药鲍曼不动杆菌gyrA基因的mRNA进行二级结构分析计算,根据最低自由能原则在其mRNA局部杂交松弛区设计反义寡核苷酸,与体外转录的地高辛标记的gyrAmRNA进行斑点杂交,根据杂交信号的强弱筛选出与gyrA mRNA紧密结合的反义寡核苷酸,根据其序列合成肽核酸(pep-tide nucleic acid,PNA),另加设1条与靶序列有6个碱基错配的PNA作为阴性对照,2条PNA分别连接穿膜肽形成肽-肽核酸(peptide-PNA,PPNA)。测定经不同浓度PPNA处理的细菌光密度[D(600)]值并进行平板菌落计数,观察其对细菌生长的抑制作用,采用RT-PCR检测gyrA mRNA的表达水平。结果斑点杂交结果显示,计算机软件设计的10条反义寡核苷酸探针中有5条与gyrA mRNA显示出杂交信号,其中1条信号最强,能够与gyrA mRNA稳定结合,将其以肽-肽核酸的形式合成处理细菌,结果表明其在5μmol/L浓度可完全抑制gyrA mRNA的表达,并抑制鲍曼不动杆菌的生长,在10μmol/L浓度具有杀菌活性,而具有错配碱基的PPNA对细菌生长无明显抑制作用。结论计算机辅助设计联合斑点杂交可在体外模拟体内环境对寡核苷酸与靶基因结合的有效性进行验证,实现在体外高通量筛选高效反义序列。经筛选得到的靶向gyrA基因反义肽-肽核酸可在体外高效抑制多重耐药鲍曼不动杆菌生长。
- 王慧娟何云燕夏云王立朋梁树梅
- 关键词：多重耐药鲍曼不动杆菌GYRA肽核酸
- 碳青霉烯类耐药的肺炎克雷伯对碳青霉烯类药物耐药机制的研究
- 王慧娟
- 靶向高迁移率族蛋白1基因的高效RNA干扰序列的筛选
- 2012年
- 目的筛选靶向晚期炎症因子高迁移率族蛋白1(High mobility group box 1 protein,HMGB1)基因的高效RNA干扰(siRNA)序列,并检测其体外生物学效应。方法选择针对HMGB1基因mRNA的3条不同序列,用T7体外转录系统合成3条siRNA,转染RAW264.7细胞,6 h后,加入500 ng/ml脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)分别刺激24、48 h,另设单纯LPS刺激组和只加培养液的对照组。采用RT-PCR检测各组细胞中HMGB1基因mRNA的转录水平,ELISA检测细胞培养上清液中HMGB1的含量。结果体外合成的HMGB1 siRNA1～3经琼脂糖凝胶电泳分析,均可见21 bp的RNA片段;经LPS刺激24和48 h,RAW264.7细胞中HMGB1基因mRMA的转录水平和细胞培养上清液中HMGB1的含量与对照组相比均显著升高,3条HMGB1 siRNA均能抑制细胞中HMGB1基因mRNA的转录水平,并减少细胞培养上清液中HMGB1的含量,其中以HMGB1siRNA1的效果最为明显。结论 LPS可刺激RAW264.7细胞释放大量HMGB1,同时增加细胞中mRNA的转录水平;HMGB1siRNA能有效降低HMGB1蛋白和mRNA水平,有望成为控制晚期炎症发展的新的治疗手段。
- 李小凤夏云苏小燕王慧娟
- 关键词：RNA干扰RAW264.7细胞
- 万古霉素耐药肠球菌耐药基因检测及分子流行病学调查被引量：8
- 2014年
- 目的：了解我院分离的万古霉素耐药肠球菌的耐药相关基因及流行情况。 方法：收集2012－2013年间分离的7株经E-test确认的万古霉素耐药肠球菌（VRE），提取基因组DNA，PCR检测van耐药基因型，多重PCR检测asal，gelE，cylA，esp，hyl 5个毒力基因；多位点序列分型（MLST）及脉冲场凝胶电泳（PFGE）进行流行病学调查。 结果：7株VRE耐药基因型van均为A型；有6株检测到毒力基因esp、hyl，其余为阴性；MLST及PFGE均显示菌株2、4、5、7为主要型别（ST 17），其余3株各不相同。 结论：我院分离的VRE耐药基因型为vanA型，毒力基因esp、hyl检出率较高，2013上半年有小规模VRE流行，应加强对于VRE的管控工作。
- 王立朋何云燕严立王慧娟梁树梅夏云
- 关键词：万古霉素肠球菌耐药脉冲场凝胶电泳多位点序列分型
