黄晓梅 作品数:6 被引量:12 H指数:2 供职机构: 扬州大学动物科学与技术学院 更多>> 发文基金: 国家自然科学基金 国家教育部博士点基金 江苏省高校自然科学研究项目 更多>> 相关领域: 农业科学 生物学 更多>>
鸡Dazl基因的克隆及其亚细胞定位研究 被引量:2 2013年 为克隆鸡Daz(lDeleted in azoospermia-like,Dazl)基因CDS序列,通过构建eGFP标记的DAZL真核表达载体,实现该基因产物的亚细胞定位以探究其生物信息学功能。提取1日龄鸡睾丸总RNA,通过巢式PCR方法扩增出Dazl基因的CDS,构建真核表达载体pEGFP-C1-DAZL。采用LipofectaminTMLTX介导重组表达载体pEGFP-C1-DAZL转染CEF细胞,48h后于荧光倒置显微镜下观察其表达定位,同时利用RT-PCR和Western-blot进一步鉴定eGFP-Dazl和蛋白水平的表达情况。结果表明:克隆出Dazl基因的完整CDS,长度870bp,共编码289个氨基酸,与公布的鸡Dazl基因(GenBank登陆号:NM_204218)CDS区同源性达99%,编码氨基酸完全一致。酶切鉴定和序列分析均表明真核表达载体pEGFP-C1-DAZL构建成功。转染48h后,RT-PCR和Western-blot分别检测到949bp特异条带和59.7ku的融合蛋白。荧光显微镜观察显示,融合蛋白(eGFP-Dazl)主要分布于细胞核。 郑蒙蒙 李伟 施青青 王丹 黄晓梅 李碧春关键词:DAZL 真核表达载体 绿色荧光蛋白 亚细胞定位 BMP4诱导鸡胚胎干细胞向雄性生殖细胞分化的研究 被引量:7 2013年 旨在探讨BMP4诱导鸡胚胎干细胞向雄性生殖细胞分化的作用机理。采用单层贴壁培养作为分化模式,分别采用10、20、30和40ng·mL-1 BMP4浓度诱导雄性鸡胚胎干细胞,通过形态学、荧光定量PCR和免疫细胞化学检测诱导效果。根据细胞形态变化和差异基因表达量变化,确定了BMP4的适宜诱导浓度为40ng·mL-1。在适宜浓度诱导过程中,诱导4d类胚体开始出现,6~8d类胚体逐渐增大,数量增多,10d部分类胚体开始散开,变为小的圆形细胞,12d在散开后的类胚体周围可观察到少量生殖样细胞,14d生殖样细胞数目增多,且呈聚团生长的趋势。诱导过程中相应基因表达量也发生变化:胚胎干细胞标记基因Nanog、Sox2表达量显著下降(P〈O.01),生殖细胞特异基因Stra8、Dazl、integrina6、c-kit表达量均呈显著上升趋势(P〈O.01)。BMP4可以引起生殖细胞相应基因的表达,促进雄性鸡胚胎干细胞向雄性生殖细胞方向分化,结果为雄性生殖细胞的体外诱导研究提供试验参考,为进一步研究雄性生殖细胞发生和调控机制提供理论基础。 施青青 张振韬 李鹏程 郑蒙蒙 王丹 黄晓梅 张亚妮 李碧春关键词:鸡胚胎干细胞 雄性生殖细胞 分化 BMP4 鸡胚原始生殖细胞生物学特性鉴定及相关基因表达研究 被引量:2 2012年 采用酶消化法分离鸡胚原始生殖细胞(PGCs),纯化后进行体外培养,传至5~6代时,通过对阶段特异性胚胎抗原-1(SSEA-1)免疫荧光标记、碱性磷酸酶检测等方法联合鉴定其基本生物学特性,同时以RT-PCR方法检测其特异基因的表达。结果表明:体外培养的PGCs维持未分化状态,碱性磷酸酶阳性、免疫荧光检测其特异标志物SSEA-1阳性。鸡胚PGCs表达减数分裂前标志基因Dazl、Nanog和GDF3,生殖细胞分化后期基因CVH,原始生殖细胞标志基因Blimp-1以及干细胞多能性相关基因Oct-4,不表达减数分裂启动基因Stra8。提示所获得的鸡胚PGCs,其生物学特性稳定,表达相关特异基因,为鸡胚PGCs的体外培养及鉴定提供理论依据。 施青青 孙敏 郑蒙蒙 王丹 黄晓梅 张亚妮 李碧春关键词:体外培养 生物学特性 鸡Stra8基因真核表达载体构建及亚细胞定位的研究 被引量:2 2013年 试验旨在克隆苏禽黄鸡视黄酸激活基因8(Stra8)的cDNA序列,构建pEGFP-C1-Stra8载体并制备鸡Stra8抗体。通过RT-PCR克隆苏禽黄鸡Stra8基因cDNA,构建pEGFP-C1-Stra8和pcDNA3.1(+)-Stra8重组质粒,分别转染NIH-3T3细胞和免疫小鼠制备抗体,间接免疫荧光法检测抗体效价以及在细胞中的分布。结果显示,苏禽黄鸡Stra8基因cDNA全长645bp,共编码214个氨基酸,提交至GenBank获得登录号为JX204292.1;成功制备Stra8多克隆抗体,pEGFP-C1-Stra8融合蛋白在NIH-3T3细胞质中表达。该结果为深入探讨禽类Stra8生物学功能奠定了基础。 王丹 张振韬 施青青 黄晓梅 朱才业 郑蒙蒙 李伟 徐剑蓉 王克华 李碧春关键词:多克隆抗体 亚细胞定位 pEGFP-hTERT转染鸡胚胎干细胞建系的研究 2014年 本研究旨在通过构建重组质粒pEGFP-hTERT转染鸡胚胎干细胞(Chicken embryonic stem cells,cESCs),优化鸡胚胎干细胞培养体系,以期构建鸡胚胎干细胞株或细胞系。在获得hTERT基因后,构建重组质粒pEGFPhTERT,并利用FuGENE^(?)HD转染鸡成纤维细胞(DF-1),转染24 h后,荧光显微镜检测;再以80%BRL-CM(大鼠肝细胞条件培养基)与20%的ES基础培养液混合的条件培养基培养分离的cES:s,添加10μmol·L^(-1)维生素C,AKP染色以及相关表面抗原SSEA-1、SOX2和OCT4检测鉴定后,以G418筛选pEGFP-hTERT转染的cES:s,传代培养后荧光定量PCR检测相关干性基因的表达水平。结果表明:维生素C可以促进cESCs增殖,pEGFP—hTERT转染的DF-1细胞中可以检测到绿色荧光表达,pEGFP—hTERT转染的cESCs可持续传至10代以上,且仍保持未分化状态,干细胞表面特异性抗原检测呈阳性,且相关干性基因的表达水平差异不显著(P>0.05)。综上表明:pEGFP-hTERT转染的cESCs在80%BRL-CM结合外源因子的作用下,能够持续稳定传至10代且仍保持未分化状态,可应用于鸡胚胎干细胞的永生化和细胞系建立。 黄晓梅 张蕾 左其生 施青青 李东 汤贝贝 张亚妮 宋九州 李碧春关键词:HTERT基因 鸡胚胎干细胞