韦建
- 作品数：3 被引量：2H指数：1
- 供职机构：山西医科大学第二医院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金更多>>
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- RNAi技术体外沉默肌肉环指蛋白1的研究
- 2013年
- 目的探讨RNAi技术体外抑制大鼠肌肉环状指蛋白1(MuRF-1)基因表达的效果,筛选出针对MuRF-1基因最有效的siRNA重组质粒。方法根据大鼠MuRF-1基因的mRNA序列,设计4组干扰序列,即siRNA MuRF1-Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ,利用lipofactamine2000转染试剂将siRNA重组质粒转染大鼠成肌细胞系L6,于转染后48 h与72 h,采用实时定量PCR和Western blot或免疫印迹检测其对MuRF-1表达的抑制效果。MuRFl基因siRNA重组质粒瞬时转染后mRNA和蛋白质数据以x±s表示。对照组与四组实验组的比较用单因素方差分析;多个样本均数的两两比较用LSD检验。结果(1)实时定量PCR显示四组干扰质粒MuRF1-Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ对基因MuRF-1的mRNA的抑制率在转染后48 h分别为67﹪、31﹪、11﹪,20﹪,不同干扰序列的抑制效果有差异(F=4.527,P=0.024);72 h分别为79﹪、59﹪、50﹪和61﹪,不同干扰序列的抑制效果有差异(F=19.088,P<0.001),与48 h相比,抑制效应更为明显,但以siRNA MuRF1-Ⅰ的抑制效果最为明显(t=8.201,P<0.001)。(2)使用Western印迹灰度分析显示四组干扰序列对基因MuRF-1的蛋白的抑制率在转染后48 h分别为61﹪、40﹪、9﹪和15﹪,不同干扰序列的抑制效果有差异(F=4.286,P=0.028);72 h分别为70﹪、54﹪、30﹪和46﹪,不同干扰序列的抑制效果有差异(F=3.731,P=0.042);与48 h相比,MuRFl-Ⅰ、MuRFl-Ⅱ抑制效应与对照组相比有显著性差异(tⅠ=3.256,P=0.009;tⅡ=2.512,P=0.03),但MuRFl-Ⅲ和MuRFl-Ⅳ与对照组相比仍无显著性差异(P>0.05)。四对序列中,以siRNAMuRF1-Ⅰ的抑制效果最为明显。蛋白水平的抑制效果与mRNA水平基本一致。结论成功筛选出对MuRF-1基因有效的siRNA重组质粒,即siRNA MuRF1-Ⅰ,为通过RNAi技术进一步研究其功能以及基因靶向治疗奠定了基础。
- 朱志祥梁炳生冯勇达志峰丁洁韦建贾英伟
- 关键词：成肌细胞质粒转染RNA干扰
- RNA干涉介导大鼠成肌细胞系L6中MuRF-1与FOXO3a基因表达变化的研究被引量：2
- 2013年
- 目的探讨RNAi技术体外抑制MuRF-1或FOXO3a基因表达的效果,为RNAi介导的失神经骨骼肌萎缩基因治疗奠定基础。方法体外培养大鼠成肌细胞系L6,将MuRF-1和(或)FOXO3a siRNA重组质粒在Lipofectamine 2000介导下转染,优化与检测系统的转染效率;将2μg MuRF-1或FOXO3a基因siRNA重组质粒转染L6,转染后48 h与72 h,采用实时定量PCR检测siRNA重组质粒对MuRF-1和FOXO3a的mRNA的抑制效果,使用Western印迹检测siRNA重组质粒对MuRF-1和FOXO3a蛋白水平的抑制效果。用单因素方差分析方法和LSD法进行组间比较。结果(1)质粒转染后24 h,荧光显微镜下可见细胞中有大量明亮的绿色荧光表达,显示系统有较高的转染效率。(2)实时定量PCR分析结果显示:MuRF-1与FOXO3a各自的siRNA重组质粒转染后48 h,二者干扰序列在mRNA水平分别明显抑制了MuRF-1和FOXO3a的表达,抑制率达67﹪和54﹪,与对照组相比差异均有统计学意义(P<0.05),联合MuRF-1与FOXO3a两基因siRNA重组质粒转染后48 h,干扰序列在mRNA水平明显抑制了MuRF-1及FOXO3a的表达,抑制率达61﹪及58﹪,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05);转染后72 h,MuRF-1与FOXO3a各自的siRNA重组质粒干扰序列对MuRF-1和FOXO3a的mRNA的抑制率分别达79﹪和81﹪,联合MuRF-1与FOXO3a两基因siRNA重组质粒干扰序列对MuRF-1和FOXO3a的mRNA的抑制率达77﹪及72﹪,与对照组相比差异均有统计学意义(P<0.05),与48 h相比,抑制效应更为明显。(3)Western印迹灰度分析结果显示:转染后48 h,干扰序列MuRF-1明显抑制了MuRF-1蛋白的表达,抑制率达61﹪,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05),干扰序列FOXO3a明显抑制了FOXO3a蛋白的表达,抑制率达46﹪,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05),联合MuRF-1与FOXO3a两基因siRNA重组质粒干扰序列对MuRF-1和FOXO3a蛋白表达的抑制率达64﹪及42﹪,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05);转染后72 h,干扰序列MuRF-1对MuRF-1蛋�
- 达志峰贾英伟丁洁朱志祥冯勇韦建梁炳生
- 关键词：肌萎缩FOXO3A去神经支配基因表达
- RNA干扰对成肌细胞系L6中FOXO3a基因表达的影响
- 2013年
- 背景:最近的研究发现,一些因子在失神经骨骼肌萎缩的过程中发挥关键性作用,其中"feak-headbox"(Foxo)转录因子是调控骨骼肌萎缩最关键的分子。目的:探讨 RNA 干扰技术体外抑制 FOXO3a 基因表达的效果。方法:6 孔细胞培养板中培养大鼠成肌细胞系 L6,使用 pEGFP-N1 与 siRNA 重组质粒等比例在Lipofectamine2000 介导下转染,优化与检测系统的转染效率;将 2 μg FOXO3a 基因 siRNA 重组质粒转染L6,转染 48 h 与 72 h。结果与结论:① p EGFP-N1 与 siRNA 重组质粒转染后 48 h,荧光显微镜下可见细胞中有大量明亮的绿色荧光表达,显示系统有较高的转染效率。②实时定量 PCR 分析结果显示,转染后 48 h 和 72 h,干扰序列 FOXO3a-Ⅰ、FOXO3a-Ⅱ、FOXO3a-Ⅲ、FOXO3a-Ⅳ对 FOXO3a mRNA 的抑制率与未转染对照组相比差异均有显著性意义(P < 0.05),转染 72 h 与 48 h 相比,抑制效应更为明显,并以 FOXO3a-Ⅰ的抑制效果最为明显。③Western 印迹灰度分析结果显示,转染后 48 h 和 72 h,干扰序列 FOXO3a-Ⅰ、FOXO3a-Ⅱ、FOXO3a-Ⅲ、FOXO3a-Ⅳ对 FOXO3a 蛋白表达的抑制率与对照组相比差异有显著性意义(P < 0.05),转染 72 h 与 48 h 相比,抑制效应更为明显,与 mRNA 水平的影响一致。结果可见 RNA 干扰技术在体外能够明显抑制叉头蛋白转录因子 FOXO3a 基因的表达,FOXO3a 基因 siRNA 重组质粒转染其干扰序列对 FOXO3a 的 mRNA 和蛋白抑制效果尚不明确,这可为 RNA 干扰介导的失神经骨骼肌萎缩基因治疗提供一种新的思路。
- 丁洁梁炳生达志峰朱志祥韦建贾英伟冯勇
- 关键词：肌萎缩FOXO3A失神经基因表达国家自然科学基金
