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抗鼠CTLA-4单链抗体的构建与表达及其免疫学活性的鉴定被引量：2: 2008年; 目的构建具有免疫学活性的抗小鼠细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)单链抗体ScFv(single chain fragment of variety region),为进一步将其应用到动物体内奠定基础。方法采用RT-PCR技术,从分泌抗小鼠CTLA-4单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞中扩增mAb的VH、VL基因,并进一步将其组装成VH-Linker-VL型的ScFv片段。将ScFv片段亚克隆至pGMET载体,测序正确后将其克隆至真核分泌型表达载体pSect2-GFP,将pSect2-GFP-ScFv纯化质粒转染中国仓鼠卵巢细胞(CHO)并进行表达,同时经Zeocin筛选稳定表达株。用Western blot方法检测ScFv融合蛋白的表达,采用ELISA检测ScFv的亲和活性。结果经Zeocin筛选2周后,CHO细胞株可稳定表达GFP-ScFv蛋白。Western blot法证实GFP-ScFv蛋白在细胞上清和细胞裂解液中均有表达,大小约55kD。ELISA检测表明,CHO培养上清中的GFP-ScFv蛋白经浓缩初纯后能与重组小鼠CTLA-4纯化抗原结合,并具有抑制亲本单抗与其结合的能力。结论成功构建了抗小鼠CTLA-4的ScFv真核表达载体,并能有效表达出具有免疫学活性的ScFv融合蛋白。; 彭国平周承吴炜孙雯田锋贺纪凯陈智; 关键词：细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4 单链抗体真核表达免疫学活性

慢性乙型肝炎患者外周血树突状细胞PD-L1表达的相关研究被引量：12: 2008年; 目的:探讨慢性乙型肝炎(CHB)患者外周血树突状细胞(DCs)的PD-L1表达水平,及其对DCs刺激T细胞增殖的影响。方法:采集22例慢性HBeAg阳性CHB患者、8例急性恢复期乙型肝炎(AHB)患者和10例健康人(NC)的外周血,分离单个核细胞(PBMC)并诱导DCs的增殖和活化。相对荧光定量PCR测定DCs的PD-L1、PD-L2分子mRNA水平,流式细胞术测定DCs表面PD-L1和PD-L2的表达率。同时,测定外周血DCs刺激同种异体反应性T细胞增殖的能力,及抗PD-L1单抗对CHB组DCs刺激功能的影响。结果:体外成功诱导了外周血DCs的增殖和成熟。与NC组相比较,CHB组和AHB组患者外周血DCs内PD-L1的mRNA水平均显著增高(P均<0.05),但CHB组和AHB组间差异无统计学意义。CHB组患者外周血DCs表面PD-L1表达率较AHB组、NC组均有明显增高(P均<0.01)。而外周血DCs的PD-L2 mRNA水平及PD-L2在DCs表面的表达率在各实验组之间无明显差异(P均>0.05)。CHB组外周血DCs刺激T细胞增殖的功能较AHB组和NC组明显降低(P均<0.01),抗PD-L1抗体能显著增强CHB患者DCs刺激T细胞反应的能力。CHB患者外周血DCs表面PD-L1表达率与血清HBV病毒载量成正相关(r=0.34,P=0.007)。结论:外周血DCs表面PD-L1表达水平在慢性HBeAg阳性乙肝患者明显升高,抗PD-L1抗体可有效增强CHB患者外周血DCs刺激T细胞增殖反应的能力,表明PD-L1的高表达可能与T细胞免疫反应低下和HBV病毒高复制密切相关。; 彭国平孙雯吴炜孙箴谈旭翡李淑萍陈智; 关键词：肝炎乙型树突状细胞免疫抑制病毒载量

乙型肝炎病毒感染不同阶段患者外周血CD4^＋CD25^＋调节性T细胞的测定被引量：4: 2008年; 目的测定HBV感染不同阶段患者外周血CD4^＋CD25^＋调节性T细胞（Treg）的频率及标记分子，并分析其与临床指标的相关性。方法采集79例慢性乙型肝炎（CHB）、12例急性乙型肝炎（AHB）患者、26例无症状HBV携带者（ASC）和20例健康对照的外周血，流式细胞仪分析Treg频率、Treg细胞表面和胞内特征性分子的表达。普通RT—PCR和相对荧光定量PCR测定叉头／翼状转录因子3（Foxp3）在CD25^＋Treg细胞的表达水平。所有患者及健康对照均经ELISA检测HBV血清标记物水平，实时荧光定量PCR测定血清HBVDNA载量，并进行肝功能检测。结果总CD4^＋CD25^＋T细胞占外周血CD4^＋T细胞的比率，在各患者组和健康对照组之间差异均无统计学意义（P〉0．05）。HBeAg阳性CHB组CD4^＋CD25高表达T细胞频率（3．42％±0．81％）与HBeAg阴性CHB组（3．19％±0．67％）、ASC组（3．05％±0．64%）比较，差异无统计学意义（均P〉0．05），但明显高于健康对照组（2．72％±0．71％，P=0．034）和AHB组（2．25％±0．54％，P=0．013）。CD4^＋CD25高表达T细胞表面高表达CD45RO、CD25分子，低表达CD45RA，细胞内高表达细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4（CTLA-4）和Foxp3。各患者组及健康对照组Treg中Foxp3表达水平的差异无统计学意义（P〉0．05）。CHB组患者的Treg频率与血清病毒载量呈正相关（r=0．48，P=0．018）。结论Treg可能通过抑制T细胞免疫应答反应而影响病毒清除，并与CHB患者的持续感染密切相关。; 彭国平孙雯孙箴蔡乃青陈智; 关键词：肝炎乙型 CD4阳性T淋巴细胞白细胞介素2 免疫耐受 FOXP3

HBV感染患者外周血T细胞PD-1基因表达水平的变化与意义被引量：11: 2007年; 目的:分析HBV感染不同阶段患者外周血T淋巴细胞中PD-1(program death factor-1)分子的基因定量表达情况,探讨PD-1表达水平与血清学指标的相关性。方法:采集并筛选HLA-A2阳性的31例慢性乙型肝炎(CHB)患者、9例急性恢复期乙型肝炎患者(AHB)、15例乙肝相关性肝硬化患者(LC)和10例健康献血者的外周血,实时荧光定量PCR分析总T细胞内PD-1的mRNA水平,同时测定其配体PD-L1、PD-L2在外周血单个核细胞(PBMCs)中的表达量;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测HBV血清标记物水平,荧光定量PCR检测血清HBV DNA载量,同时进行肝功能检测。结果:以各基因在正常对照组的定量表达水平为基础值,HBeAg阳性CHB组T细胞内PD-1和PBMCs内PD-L1的mRNA表达水平明显升高,与HBeAg阴性CHB组和AHB组比较均有显著性差异,但与LC组比较无统计学意义(P>0.05)。外周血PBMCs内PD-L2的mRNA水平在各实验组中无明显差异(P均>0.05)。在所有检测的CHB患者中,外周血T细胞内PD-1表达水平在高病毒载量组(HBV DNA≥107拷贝/ml)明显高于低病毒载量组(HBV DNA<107拷贝/ml)和正常对照组,且与血清HBV病毒载量成正相关(r=0.41,P<0.01),但与血清ALT水平无明显相关性。结论:外周血T细胞中PD-1基因水平在慢性乙型肝炎患者组,尤其是在HBeAg阳性组和高病毒载量组明显上调,提示T细胞高表达的PD-1可能通过与其配体PD-L1作用而抑制T细胞免疫应答,并导致病毒持续感染。; 彭国平孙雯孙箴朱嘉珺李淑萍陈智; 关键词：免疫抑制病毒载量

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孙雯

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