江月
- 作品数：3 被引量：6H指数：1
- 供职机构：重庆医科大学更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 串联亲和纯化技术筛选肠病毒71型3D聚合酶的相互作用蛋白被引量：5
- 2012年
- 目的利用串联亲和纯化技术筛选与肠病毒71型3D聚合酶相互作用的宿主细胞蛋白。方法利用RT-PCR方法从EV71BrCr株全基因组中获得3D聚合酶全长基因,构建pcDNA3.0-3D-Flag-HA真核表达载体并转染RD细胞,48 h后收集细胞。用Western blot方法检测3D蛋白在RD细胞内的表达情况。串联亲和纯化技术筛选与3D聚合酶相互作用的宿主蛋白并进行质谱分析,确定与3D聚合酶相互作用的蛋白或多肽。并采用免疫共沉淀实验,对候选蛋白CyclinG1与3D的相互作用进行验证。结果成功构建了pcDNA3.0-3D-Flag-HA载体,在RD细胞内检测到3D蛋白的表达。经串联亲和纯化和质谱分析得到LATS2、Nek2、APC5、CyclinG1、PI3K等一系列参与细胞凋亡及细胞周期调控的蛋白。免疫共沉淀实验证实3D蛋白与CyclinG1的相互作用。结论 3D聚合酶可能与宿主细胞内蛋白相互作用,引起细胞凋亡及细胞周期改变。
- 江月丛浩龙王健李梨
- 关键词：肠道病毒71型串联亲和纯化
- EV71 3D真核表达载体构建及相互作用蛋白筛选的实验研究
- 目的：肠道病毒71型(Enterovirus71，EV71)是手足口病的主要病原体之一。为深入研究EV713D聚合酶的功能及作用机制，本实验构建EV713D真核表达载体并利用串联亲和纯化技术筛选与EV713D聚合酶相互作...
- 江月
- 关键词：肠道病毒71型真核表达载体相互作用蛋白
- 肠道病毒71型3C基因原核表达质粒的构建表达及纯化
- 2012年
- 目的构建肠道病毒71型(Entervirus71,EV71)3C基因的原核表达质粒,在大肠杆菌中进行表达并纯化。方法以病毒的反转录产物为模板,PCR扩增EV71 3C基因,克隆至pGEx-4T-1载体中,构建重组表达质粒pGEx-3C,转化大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达。表达的重组融合蛋白GSR-3C经GST-Agarose亲和层析和分子筛层析纯化后,Western blot检测其反应原性。结果重组表达质粒pGEx-3C经双酶切及测序证实构建正确;表达的重组融合蛋白相对分子质量约46 000,表达量约占菌体总蛋白的50%,主要以可溶性形式表达;纯化后的重组融合蛋白纯度大于90%,可与小鼠抗EV71单克隆抗体特异性结合。结论成功构建了重组表达质粒pGEx-3C,在大肠杆菌中高效分泌表达并纯化了重组GST-3C融合蛋白,为EV713C蛋白酶结构与功能的研究及3C靶向药物和疫苗的研究奠定了基础。
- 江月丛浩龙李梨
- 关键词：原核细胞基因表达纯化
