温坤
- 作品数：33 被引量：100H指数：5
- 供职机构：南方医科大学珠江医院更多>>
- 发文基金：国家科技重大专项广东省科技计划工业攻关项目国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生农业科学文化科学自动化与计算机技术更多>>
- SARS-CoV核衣壳蛋白单克隆抗体识别抗原位点的分析被引量：4
- 2004年
- 丘立文潘玉先王亚娣温坤郝卫车小燕
- 关键词：SARS-COVN蛋白核衣壳蛋白抗原位点膜蛋白
- 非结构蛋白1抗原捕获酶联免疫吸附法评价登革病毒抗体中和活性被引量：4
- 2009年
- 目的在获得具有中和活性的针对Ⅰ型登革病毒（dengue virus serotype Ⅰ，DENV-1）的抗体基础上，评价已建立的非结构蛋白Ⅰ（nonstructural protein 1，NS1）抗原捕获酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）分析抗体中和活性的可行性，为中和抗体的筛选和疫苗效果的评价提供一个更为快速、简便的检测方法。方法使用重组DENV-1包膜蛋白Ⅲ区（envelope protein domain Ⅲ，EDⅢ）免疫5只BALB／c小鼠制备单克隆抗体（简称单抗），采用间接ELISA、间接免疫荧光法（immunofluorescence assay，IFA）和免疫印迹法（Western Blot）对单抗进行筛选及鉴定；同时用该重组蛋白免疫1只新西兰兔，制备多克隆抗体血清；以传统噬斑减少中和试验（plaque reduction neutralization test，PRNT）作为参比方法，采用NS1抗原捕获ELISA对所获抗体进行中和活性检测。结果获得4株针对DENV-1 EDⅢ单抗和1份兔多抗血清，且被PRNT试验证明均具有中和活性，四株单抗腹水（1A1、1B3、3D3、9D6）和兔多抗血清中和效价分别为1：1024、1：512、1：256、1：4096和1：4096。使用NS1抗原捕获EHSA法检测不到PRNT中和效价最低的3D3抗体对DENV-1有中和能力，而检测其余3株单抗（1A1、1B3、9D6）和多抗兔血清中和效价均远低于PRNT测定结果，分别为1：32、1：32、1：128和1：128。结论简单、快速的NS1抗原捕获ELISA可用于评价DENV抗体的中和活性，该方法适合于高效价中和抗体的筛选，有望成为评价疫苗效果的方法之一。
- 温坤丁彦青丘立文潘玉先蔡建飘岳彩峰狄飚车小燕
- 关键词：登革热病毒病毒包膜蛋白质类酶联免疫吸附测定病毒非结构蛋白质类
- 禽流感病毒H5N1血凝素基因在昆虫细胞中的表达及鉴定被引量：4
- 2007年
- 目的应用杆状病毒-昆虫细胞表达体系克隆及表达禽流感病毒H5N1血凝素H5抗原,鉴定其抗原性和生物活性。方法PCR扩增禽流感病毒H5全长基因序列,克隆、转化制备重组杆状病毒Bacmid质粒,通过转染昆虫细胞制备重组杆状病毒进行蛋白表达。采用细胞免疫荧光、Westernblotting和血凝试验分别对表达的蛋白进行抗原性和生物活性分析。结果在昆虫细胞中成功表达禽流感病毒重组his-H5蛋白,其相对分子质量约为64000,与豚鼠红细胞能够发生凝集反应,免疫荧光与Westernblotting结果提示该重组蛋白能够与禽流感病毒H5标准血清中的抗体特异性结合。结论经杆状病毒-昆虫细胞表达系统获得的重组his-H5抗原具备天然的生物活性和抗原性,该方法为进一步研究禽流感病毒血凝素抗原生物学特性以及制备亚单位疫苗、相关抗体奠定了基础。
- 温坤丘立文王压娣车小燕
- 关键词：禽流感病毒杆状病毒昆虫细胞
- Ⅰ～Ⅳ型登革病毒包膜蛋白B细胞中和表位的鉴定被引量：1
- 2015年
- 登革病毒包膜蛋白（Dengue virus envelope protein,DENV E）是诱导中和抗体主要的蛋白,登革病毒包膜蛋白Ⅲ区（Dengue virus envelope protein domainⅢ,DENV EDⅢ）是构建DENV亚单位疫苗的主要靶标,但是其B细胞中和表位目前了解不多。我们采用两组覆盖DENV-1EDⅢ的重叠多肽（12肽和16肽）同27株针对DENV-1EDⅢ中和单抗反应,筛选DENV EDⅢ上B细胞表位。采用该方法,我们发现了一高度保守的Ⅰ～Ⅳ型DENV共同交叉中和B细胞表位和一高度保守的DENV-1血清型特异性B细胞中和表位,分别位于DENV-1E蛋白氨基酸残基序列第309~320位和第381~392位（Amino acid residues 309~320,and 381~392;aa 309~320和381~392）。Ⅰ～Ⅳ型DENV共同交叉中和B细胞表位在Ⅰ～Ⅳ型DENV分离株中存在高度保守共同序列310 KEVAETQHGT319,DENV-1E蛋白中E309、V312、A313和V320不影响蛋白抗原性。DENV-1血清型特异性B细胞中和表位（DENV-1E蛋白氨aa 381~392）在DENV-1分离株中高度保守,在黄病毒属其它病毒中不保守。我们也发现一具有DENV-1分离株特异性的B细胞中和表位位于DENV-1E蛋白氨基酸残基序列第329~348位。这些新发现的DENV-1E蛋白EDⅢ上B细胞中和表位可能有助于研制新的DENV亚单位疫苗。
- 林亚英温坤郭勇晖丘立文潘玉先余楠狄飚陈月
- 关键词：登革病毒中和抗体B细胞表位
- Ⅰ型登革病毒包膜蛋白Ⅲ区中和抗体的制备与鉴定被引量：5
- 2015年
- 目的研制Ⅰ型登革病毒包膜蛋白Ⅲ区(dengue virus 1 envelope protein domainⅢ,DENV-1 EDⅢ)单克隆抗体,并鉴定其血清型特异性、相对表位和中和活性。方法采用DENV-1 EDⅢ重组蛋白为免疫原,免疫Balb/c小鼠,制备抗DENV-1 EDⅢ单抗,鉴定单抗的免疫学特性和交叉反应性,噬斑减少中和实验鉴定其中和活性,抗体与抗体间竞争抑制分析相对表位。结果共获得抗DENV-1 EDⅢ单抗28株,其Ig亚类鉴定24株为Ig G1,2株为Ig G2a,2株为Ig G2b,包含13株DENV-1血清型特异性单抗,9株DENV病毒特异性单抗,其它6株交叉反应性单抗以不同的方式同各型DENV EDⅢ反应,至少识别5个不同位点,其中27株抗体对不同血清型登革病毒表现出不同的中和活性。结论成功获得了针对DENV-1 EDⅢ的特异性单抗及交叉性中和单抗,将为进一步研究登革病毒EDⅢ蛋白的结构与功能、疫苗和治疗性抗体的研发奠定基础。
- 林亚英丁细霞朱伟陈月潘玉先郝卫狄飚温坤
- 关键词：登革病毒中和抗体
- 人冠状病毒SARS-CoV、229E和OC43核衣壳(N)蛋白单克隆抗体的制备及3株人冠状病毒N蛋白的抗原相关性观察被引量：2
- 2006年
- 目的通过制备和鉴定人冠状病毒SARS-CoV、229E和OC43核衣壳(N)蛋白单克隆抗体(mAb),观察3株人冠状病毒的N蛋白抗原相关性。方法分别用基因重组SARS-CoV、229E和OC43N蛋白免疫BALB/c小鼠,制备mAb,并采用ELISA间接法、免疫印迹和免疫荧光进行筛选和鉴定,同时用mAb分析3株人冠状病毒N蛋白之间的免疫交叉反应。结果获得多株抗SARS-CoV、229E和OC43 N蛋白mAb杂交瘤细胞株,ELISA间接法、免疫印迹和免疫荧光结果均显示,所有的mAb仅与各自病毒的N蛋白特异性反应,而在3株人冠状病毒N蛋白抗原之间不产生免疫交叉反应。结论获得的特异性抗人冠状病毒N蛋白mAb为进一步研究3株人冠状病毒的抗原决定簇相关性奠定了基础。
- 丘立文王压娣廖志勇温坤车小燕
- 关键词：单克隆抗体冠状病毒核衣壳蛋白抗原性
- 1型登革病毒包膜蛋白功能区在293T细胞中的表达与鉴定
- 2015年
- 目的在293T细胞中获得可溶性表达的1型登革病毒（DENV1）包膜（E）蛋白。方法PCR扩增DENV1-E蛋白功能区（1～394aa）基因并克隆到Psectag2B-Fc真核表达载体中构建表达质粒，脂质体法转染293T细胞，经2mg／ml Zeocin筛选，免疫荧光法鉴定所获细胞克隆：Protein-G亲和层析纯化DENV1-E-Fc重组融合蛋白，间接免疫荧光和蛋白免疫印迹法鉴定蛋白的完整性和抗原性。结果获得稳定可溶性表达重组融合蛋白的细胞克隆，蛋白产量约为25μg／1×107个细胞，纯化得到的DENV1-E-Fc蛋白相对分子质量约90×103，该蛋白可与识别天然构象E蛋白的单克隆抗体结合，并与免疫动物血清有良好的反应性。结论在真核细胞中成功获得可溶性表达的DENV1-E-Fc重组融合蛋白，E蛋白功能区保持完整且具备天然的构象表位和良好的抗原性，为包膜蛋白的保护性抗原表位和功能研究奠定了基础。
- 郭勇晖易海粟陈静丁细霞狄飚车小燕温坤
- 关键词：包膜蛋白真核表达
- Ⅰ型登革病毒NS1蛋白检测体系的建立及在2014年广东登革疫情诊断中的应用被引量：4
- 2016年
- 目的以Ⅰ型登革病毒（DENV）非结构蛋白1（NS1）为免疫原制备NS1特异性单克隆抗体,建立Ⅰ型登革病毒NS1抗原特异性检测方法,并应用于广东以Ⅰ型登革感染为主的临床血清标本检测。方法用原核表达的重组登革病毒NS1蛋白和灭活的Ⅰ型登革病毒免疫Balb/c小鼠,通过细胞融合,间接ELISA、免疫荧光和免疫印迹鉴定,获得DENV1NS1特异性单克隆抗体并建立检测方法。结果共获得26株Ⅰ型登革病毒NS1蛋白特异性结合的单抗。通过对26株1型登革病毒NS1蛋白特异性单抗进行多株抗体组合配对,最终筛选出最佳抗体组合。该组合检测DENV1病毒培养上清的检测限为1∶16 384（12.5 pfu/ml）,且与其他3个血清型登革病毒、乙型脑炎病毒和黄热病毒均无交叉反应,对500份健康人血清标本检测中,阴性标本497例,临界3例,对发病0~13 d的836份临床确诊的登革热患者血清检测的敏感性为85.6%,明显高于q RT-PCR检测体系（66.3%）（P〈0.001）,亦明显高于病毒分离诊断率（P〈0.001）。结论成功获得了1组DENV1-NSl蛋白的特异性单克隆抗体,利用该组抗体建立了1种敏感性和特异性更好的只针对DENV1-NS1蛋白的双抗体夹心检测方法,且比其他方法能够覆盖更宽泛的时间范围,该方法可作为登革热早期诊断的工具。
- 丁细霞潘玉先陈月丘立文陈满君温坤郭勇晖余楠车小燕富宁
- 关键词：登革病毒非结构蛋白单克隆抗体
- SARS抗体检测方法的建立与IgG变化规律被引量：4
- 2004年
- 目的 :检测分析SARS患者血清IgG抗体产生情况 ,研究一种新的SARS冠状病毒IgG抗体检测方法的实际效果和临床意义。方法 :利用基因重组SARS冠状病毒核壳抗原 (N )建立间接ELISA法 ,检测SARS确诊、疑似患者及其他呼吸道疾病患者共 3 78份血清标本中的特异性IgG抗体。结果 :以A450 值 =2 1× 2 0 0例健康献血员均值作为抗体阳性判断的临界值 ,IgG的阳性临界值 0 2 3 9,对 160份SARS确诊病人、176份疑似病例和 42例对照病例血清IgG抗体检测结果进行分析 ,对于确诊病例发病 1周内 ,IgG抗体检测阳性率为 5 63 % ,发病第 2周 ,IgG检出阳性率为 62 86% ,第 3周为 92 5 9%。结论 :机体产生针对SARS冠状病毒核壳抗原的IgG抗体 ,在 1周后逐渐升高 ,持续时间长 ,证明在SARS冠状病毒致病转归机制中可能起重要作用 ,并且可作为SARS检测的重要手段。
- 许寅超郝卫丘立文潘玉先温坤冯常森车小燕
- 关键词：IGG抗体SARS冠状病毒血清IGG抗体检测
- 捕获ELISA法测定抗EV71-IgM抗体用于EV71感染早期诊断被引量：15
- 2012年
- 目的探讨捕获ELISA法测定抗肠道病毒71型(EV71)IgM抗体在EV71感染所致手足口病(HFMD)早期诊断中的价值。方法以实时荧光RT-PCR检测89例临床初诊为HFMD患儿的粪便、疱疹液、咽拭子或肛拭子的肠道病毒RNA。用40例排除HFMD的5岁以下儿童血清为抗EV71-IgM抗体阴性对照,以捕获ELISA法检测患儿不同发病期血清中抗EV71-IgM抗体。结果经实时荧光RT-PCR检测,89例HFMD患儿粪便、疱疹液、咽拭子或肛拭子中EV71感染28例,柯萨奇病毒A16(CA16)感染43例,非EV71和CA16的肠道病毒感染14例,非肠道病毒感染4例。EV71感染者发病1～3 d、4～6 d及>6 d的血清抗EV71-IgM抗体阳性率分别为81.3%、100%和100%;CA16感染者分别为10.0%、26.4%和65.7%;非EV71和CA16的肠道病毒感染者及非肠道病毒感染者在发病1～3 d和4～6 d无1例阳性;阴性对照组无1例阳性。抗EV71-IgM抗体在EV71感染的早期(急性期)的诊断敏感性和特异性分别为81.3%和92.9%。结论 EV71感染者与CA16感染者血清抗EV71-IgM抗体在发病4 d后存在较明显的交叉反应。抗EV71-IgM抗体可用作EV71感染早期诊断的血清学标志物。
- 林裕龙温坤王压娣晋晶车小燕
- 关键词：手足口病肠道病毒
