徐小静
- 作品数：2 被引量：21H指数：2
- 供职机构：中国农业大学生物学院植物生理学与生物化学国家重点实验室更多>>
- 相关领域：农业科学生物学更多>>
- 豌豆肌动蛋白异型体(PEAc1)与绿色荧光蛋白融合基因的原核表达与特性分析被引量：18
- 2004年
- 肌动蛋白普遍存在于真核生物细胞中, 并在细胞生命活动中发挥重要作用. 在细胞中, 肌动蛋白多以异型体(isoform)形式存在. 植物肌动蛋白异型体的大量获得和理化特性分析一直是一个难题. 对豌豆肌动蛋白异型体PEAc1与组氨酸标签(His-tag)、绿色荧光蛋白(GFP)进行了基因融合和原核表达. 通过脲变性、梯度脲透析复性、镍柱亲和层析的方法从包涵体中纯化出大量、高纯度的PEAc1-GFP融合蛋白(> 2 mg/L培养物). 理化特性分析表明, 它同鸡骨骼肌肌动蛋白一样, 单体PEAc1-GFP能与DNaseⅠ 结合并显著抑制后者酶活性; 单体PEAc1-GFP能聚合成带有绿色荧光的丝状结构; 聚合的PEAc1- GFP能被微丝的特异标记物鬼笔环肽(phalloidin)标记; PEAc1-GFP与鸡骨骼肌肌动蛋白的聚合曲线趋势基本一致, 聚合临界浓度为0.24 mmol/L; 聚合的PEAc1-GFP能激活肌球蛋白Mg-ATPase活性, 其激活比率随浓度的增加而增加, 在1 mg/mL浓度下, 能激活4倍以上. 上述结果表明, 带有组氨酸标签和GFP标记的PEAc1表现出和天然肌动蛋白相似的理化特性; 基因融合、原核表达、变性、复性及亲和纯化是获得大量高纯度植物肌动蛋白异型体的有效方法.
- 张少斌任东涛徐小静刘国琴
- 关键词：肌动蛋白原核表达理化性质豌豆绿色荧光蛋白
- 拟南芥磷酸肌醇特异性磷脂酶AtPLC6基因的克隆与表达被引量：3
- 2004年
- 利用文库筛选和RT—PCR方法,从拟南芥中克隆到长度为1954 bp,包括全长1734 bp编码区的 AtPLC6 cDNA,推测其编码一含有578个氨基酸的多肽,其等电点为7.24,分子量为66251.84 Da.在 GenBank中进行序列比对发现,AtPLC6为一新发现的拟南芥PI—PLC基因.对推测的氨基酸序列结构的 分析表明,AtPLC6具有EF手性结构、x结构域、Y结构域和C2结构域,与植物中已知的其他磷酸肌 醇特异性磷脂酶C(PI—PLC)在结构上相似,类似于动物中典型的δ-型磷酸肌醇特异性磷脂酶.将 AtPLC6的编码区序列插入原核表达载体后进行了原核表达,纯化的AtPLC6重组蛋白可水解PIP2产生 IP3和DAG,且水解活性呈明显的钙依赖特性,反应的最适Ca2+浓度为10 μmol/L.Northern分析结果表明,在检测的根、茎、叶、花、果和幼苗中均有AtPLC6mRNA的转录,但转录水平较低.用ABA, NaCl,冷和热等胁迫处理的实验表明,AtPLC6 mRNA的转录受到冷胁迫的诱导,而受ABA,NaCl和热 等胁迫影响较小,推测AtPLC6可能参与了植株对冷胁迫的响应.
- 徐小静曹志翔刘国琴Madan K.Bhattacharrya任东涛
- 关键词：拟南芥基因克隆原核表达冷胁迫磷酸肌醇
