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2型猪链球菌AdcR蛋白的原核表达被引量：2: 2015年; 目的表达2型猪链球菌(Streptococcus suis 2)调控因子AdcR蛋白,为研究其在2型猪链球菌中调控组氨酸三聚体家族蛋白的作用机制奠定基础。方法通过与相关家族蛋白进行同源性比较,在2型猪链球菌05ZYH33全基因组序列中找出编码AdcR的基因。以AdcR基因序列为基础,利用Primer5.0设计引物,采用PCR扩增AdcR基因,经BamHⅠ和HindIII双酶切后将目的片段通过T4DNA连接酶连接至表达载体pET32a,转化大肠埃希菌E.coli BL21,加入IPTG至终浓度为0.1mmol/L,37℃诱导4h表达AdcR蛋白,然后利用His亲和层析柱纯化AdcR蛋白。结果通过Blast分析,从2型猪链球菌05ZYH33全基因组序列中找到编码AdcR的编码基因05SSU0109。以合成的特异引物PCR扩增出469bp的AdcR片段,连接原核表达载体pET32a后转化E.coli,经IPTG 37℃诱导4h,成功表达出AdcR蛋白,其分子质量单位为40ku,与理论值相符。经His-Tag亲和层析纯化,获得较高纯度的重组AdcR蛋白。结论在大肠埃希菌中成功表达了可溶性的AdcR重组蛋白,为AdcR在2型猪链球菌中调控组氨酸三聚体家族蛋白作用机制研究奠定了基础。; 王玲倪华邵珠卿侯田青过雨晴杜世仁胡丹王长军潘秀珍; 关键词：2型猪链球菌克隆

Sao蛋白多克隆抗体制备鉴定及促全血杀菌作用被引量：5: 2014年; 目的制备2型猪链球菌(S.suis 2)表面抗原一(Sao)重组蛋白的多克隆抗体,鉴定其免疫学特性。方法通过PCR从2型猪链球菌中国强毒株05ZYH33基因组中扩增基因Sao,构建重组表达质粒pET28a-Sao,转化E.coli BL21,异丙基硫代半乳糖苷诱导表达目的蛋白,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定表达产物,His亲和层析柱纯化重组蛋白,利用纯化后Sao蛋白制备多克隆抗体,间接酶联免疫吸附试验检测抗体效价,Western blot鉴定抗体特异性,评价Sao多克隆抗体的促全血杀菌作用。结果构建的重组质粒可以在宿主菌中高效表达,纯化后获得的重组蛋白纯度可达90%;间接酶联免疫吸附试验测定Sao多克隆抗体效价为1∶102400;Western blot结果显示,Sao多克隆抗体有较好的特异性;全血杀菌实验显示,05ZYH33在含有Sao多抗血清的全血中相对存活率下降85%。结论本研究制备的2型猪链球菌重组Sao蛋白多克隆抗体效价高,特异性好,可明显增强全血对细菌的杀伤作用。; 王晶李敏刘文静杜骁杰王玲李先富王长军潘秀珍高基民; 关键词：2型猪链球菌原核表达多克隆抗体

猪链球菌真核样丝氨酸/苏氨酸激酶stk基因敲除株的构建被引量：4: 2013年; 目的构建猪链球菌(Streptococcus suis,S.suis)2型强毒株05ZYH33真核样丝氨酸/苏氨酸激酶(eukaryoticlike Ser/Thr kinase,eSTK)stk基因敲除突变株。方法构建中间为壮观霉素抗性基因(Spcr),两侧为stk编码基因上下游同源序列的基因敲除质粒,通过同源重组筛选stk编码基因敲除突变株。结果组合PCR分析和基因测序结果均显示stk编码基因完全被壮观霉素抗性基因替代,基因敲除突变株△stk构建成功。逆转录PCR(RT-PCR)证实了stk在转录水平上的缺失。对筛选的突变株进行连续传代培养,证实△stk能够保持稳定的壮观霉素抗性表型。结论 stk基因敲除突变株的成功构建,为阐明该基因在猪链球菌致病过程中的作用奠定基础。; 杜骁杰王玲郑峰李敏王晶胡丹李先富王长军潘秀珍; 关键词：猪链球菌苏氨酸激酶基因敲除突变株

2型猪链球菌丝氨酸/苏氨酸磷酸酶重组蛋白的制备及鉴定被引量：2: 2014年; 目的链球菌丝氨酸/苏氨酸磷酸酶(serine/threonine phosphotase,STP)是重要的磷酸化信号调控系统成员之一。文中对2型猪链球菌(Streptococcus suis serotype 2,S.suis 2)STP编码基因stp进行原核表达并对纯化蛋白进行酶活测定。方法对S.suis 2 stp进行生物信息学分析,PCR扩增stp基因片段,构建重组表达载体pET28a::stp。将载体转入E.coli BL21中,经IPTG诱导,Ni2+亲和层析柱纯化重组蛋白,SDS-PAGE和Western blot鉴定,利用磷酸对硝基苯酯(p-nitrophenyl phosphate,pNPP)为底物测定其水解量进而鉴定磷酸酶活性。结果从05ZYH33基因组中PCR扩增到810 bp的片段,经连接获得重组表达载体pET28a::stp;经诱导表达及纯化获得相对分子质量为32000的重组蛋白,该蛋白在Mn2+存在下能够水解pNpp。结论获得纯度较高的STP重组蛋白,该蛋白具有Mn2+依赖的磷酸酶活性,为后续阐明STK/STP磷酸化系统的调控机制打下基础。; 杜骁杰郭静静王晶李敏王玲王长军潘秀珍; 关键词：2型猪链球菌

2型猪链球菌丝氨酸/苏氨酸激酶对细菌生物学特性的影响被引量：3: 2014年; 猪链球菌是一种重要的人兽共患病病原菌,有33个血清型[1].2型猪链球菌致病力最强,可引起脑膜炎、关节炎、败血症等[2].信号转导系统对细菌应对外界复杂的环境变化有着重要的作用.本课题组前期在对2型猪链球菌中国强毒株05ZYH33基因组测序的研究中发现和真核生物同源的丝氨酸/苏氨酸激酶stk,利用同源重组原理成功构建了stk基因敲除突变株[3],本文进一步研究stk缺失后细菌生物学特性的变化.; 杜骁杰倪华王玲郑峰胡丹王长军潘秀珍; 关键词：生物学特性苏氨酸激酶猪链球菌细菌信号转导系统人兽共患病

染色质免疫共沉淀法对猪链球菌反应调控因子CovR靶基因的筛选被引量：2: 2013年; 目的猪链球菌CovR是具有全局调控作用的负反应调控因子。文章采用染色质免疫共沉淀(chromatin immu-noprecipitation,ChIP)方法筛选转录调控因子CovR的靶基因,为进一步开展CovR调控机理研究提供条件。方法利用甲醛固定猪链球菌2型05ZYH33菌株活细胞,超声波破碎法将DNA随机断裂成100～500bp大小不同的片段,再利用CovR特异性单抗免疫沉淀该蛋白质-DNA片段解交联并分离纯化DNA。针对8个潜在的靶标基因启动子区设计引物,分别用设计的引物对免疫共沉淀的DNA样品进行PCR扩增,验证CovR与DNA的结合。结果最佳ChIP实验条件为1%甲醛交联DNA与蛋白质的复合物;功率80 W、工作10 s、间隔30 s、超声40次破碎该复合物,可得到100～500 bp大小不同的片段用于后续实验。PCR结果显示SSU1668基因和SSU1732基因启动子区扩增出阳性条带,另外6种基因的启动子区未扩增出阳性条带。结论 CovR抗体免疫沉淀得到的DNA片段中含有SSU1668基因和SSU1732基因启动子区,表明SSU1668基因和SSU1732基因是CovR的靶基因。; 郭静静王玲杜骁杰李敏王晶李先富郑峰胡丹王长军潘秀珍; 关键词：猪链球菌2型

2型猪链球菌表面蛋白Sao的生物信息学分析及基因工程疫苗的设计被引量：11: 2014年; 目的利用生物信息学方法分析Sao蛋白结构并预测B细胞抗原表位,筛选可用于疫苗设计的序列。方法以Sao蛋白的氨基酸序列为基础,利用Protparam工具分析蛋白基本理化性质,TMHMM预测跨膜区,PredictProtein在线分析蛋白二级结构,SWISS-MODEL软件模拟三级空间构象,DNASTAR分析亲(疏)水性、可塑性和表面可及性,综合使用在线ABCPred和BepiPred工具预测B细胞抗原表位,筛选能用于构建基因工程疫苗的蛋白序列。结果 Sao蛋白羧基端存在7个高度一致的重复序列以及1个LPVTG保守膜锚定基序,二级结构组分中无规卷曲比例高达74.21%,三级空间构象模拟结果与二级结构预测一致。蛋白的亲水区域、可塑性区域、表面可及性区域比例分别为76.21%、64.06%和75.04%。Sao存在多个线性抗原表位,经筛选得到两个可用于疫苗设计的蛋白序列,BLAST显示这两个序列为猪链球菌所特有,存在于2型猪链球菌9种不同的分离菌株中,同时也存在于猪链球菌致病性血清型1、2、1/2、3、7、9、14型中。结论 Sao蛋白为不稳定蛋白,亲水性强,筛选得到的两个蛋白序列抗原性强且高度保守,为猪链球菌特有序列,能够用于基因工程疫苗的构建。; 王晶李敏杜骁杰王玲李先富王长军高基民潘秀珍; 关键词：2型猪链球菌抗原表位预测疫苗

狗甲状腺C细胞的几种镀银显示法: 1984年; 1932年Nonidez[1]在用Cajal氏硝酸银还原法研究狗的甲状腺时,发现甲状腺内有另一种嗜银性上皮细胞存在,并称之为滤泡旁细胞(Parafollicular Cell)。1966年Pearse[2]因其能分泌降钙素(Calcitonin),而称其为降钙素细胞,简称C细胞。; 涂翰芬王玲; 关键词：组织块石蜡切片内分泌腺镀银银染色显示法

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王玲

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