杜骁杰
- 作品数：10 被引量：24H指数：4
- 供职机构：中国人民解放军南京军区军事医学研究所更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金江苏省自然科学基金南京军区医学科技创新课题更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 真核样丝氨酸/苏氨酸激酶在链球菌中的研究进展被引量：4
- 2014年
- 有机体的生存需要不断应对变化的环境。信号转导系统的存在有助于生物对不同的内外界信号做出相应的回应。蛋白质的磷酸化是信号转导的重要机制,二元信号转导系统(two-component signal transduction system,TCSTS)是细菌最普遍的信号转导方式,然而最早在真核生物中发现的丝氨酸、苏氨酸的磷酸化在原核生物中已成为研究的热点。丝氨酸/苏氨酸激酶与磷酸酶的协同作用与致病菌各种生命活动息息相关,包括生长,代谢,毒力以及应激压力等。本文重点介绍几种常见的链球菌中的丝/苏氨酸激酶,了解其在致病菌中的作用。鉴于真核生物STK已有大量的抑制剂被广泛使用,对链球菌真核样丝/苏氨酸激酶STK(eukaryotic-like Ser/Thr kinase,eSTK)的深入了解将有助于寻找应对链球菌感染的预防和治疗手段。
- 杜骁杰潘秀珍
- 关键词：磷酸化链球菌苏氨酸激酶
- 猪链球菌真核样丝氨酸/苏氨酸激酶stk基因敲除株的构建被引量：4
- 2013年
- 目的构建猪链球菌(Streptococcus suis,S.suis)2型强毒株05ZYH33真核样丝氨酸/苏氨酸激酶(eukaryoticlike Ser/Thr kinase,eSTK)stk基因敲除突变株。方法构建中间为壮观霉素抗性基因(Spcr),两侧为stk编码基因上下游同源序列的基因敲除质粒,通过同源重组筛选stk编码基因敲除突变株。结果组合PCR分析和基因测序结果均显示stk编码基因完全被壮观霉素抗性基因替代,基因敲除突变株△stk构建成功。逆转录PCR(RT-PCR)证实了stk在转录水平上的缺失。对筛选的突变株进行连续传代培养,证实△stk能够保持稳定的壮观霉素抗性表型。结论 stk基因敲除突变株的成功构建,为阐明该基因在猪链球菌致病过程中的作用奠定基础。
- 杜骁杰王玲郑峰李敏王晶胡丹李先富王长军潘秀珍
- 关键词：猪链球菌苏氨酸激酶基因敲除突变株
- Sao蛋白多克隆抗体制备鉴定及促全血杀菌作用被引量：5
- 2014年
- 目的制备2型猪链球菌(S.suis 2)表面抗原一(Sao)重组蛋白的多克隆抗体,鉴定其免疫学特性。方法通过PCR从2型猪链球菌中国强毒株05ZYH33基因组中扩增基因Sao,构建重组表达质粒pET28a-Sao,转化E.coli BL21,异丙基硫代半乳糖苷诱导表达目的蛋白,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定表达产物,His亲和层析柱纯化重组蛋白,利用纯化后Sao蛋白制备多克隆抗体,间接酶联免疫吸附试验检测抗体效价,Western blot鉴定抗体特异性,评价Sao多克隆抗体的促全血杀菌作用。结果构建的重组质粒可以在宿主菌中高效表达,纯化后获得的重组蛋白纯度可达90%;间接酶联免疫吸附试验测定Sao多克隆抗体效价为1∶102400;Western blot结果显示,Sao多克隆抗体有较好的特异性;全血杀菌实验显示,05ZYH33在含有Sao多抗血清的全血中相对存活率下降85%。结论本研究制备的2型猪链球菌重组Sao蛋白多克隆抗体效价高,特异性好,可明显增强全血对细菌的杀伤作用。
- 王晶李敏刘文静杜骁杰王玲李先富王长军潘秀珍高基民
- 关键词：2型猪链球菌原核表达多克隆抗体
- 猪链球菌2型甲基受体趋化蛋白编码基因05SSU0273的原核表达及纯化
- 2013年
- 目的原核表达猪链球菌2型甲基受体趋化蛋白编码基因05SSU0273。方法通过PCR方法检测该基因在不同血清型猪链球菌中的分布情况,然后利用获得的猪链球菌2型05SSU0273基因片段,构建重组表达载体pET32a::05SSU0273。将质粒转入E.coli BL21中,经IPTG诱导,SDS-PAGE和Western blot实验证实目的基因的表达,然后以His亲和层析柱纯化重组蛋白。结果在S.suis 2 35个血清型标准株中,有20株分离株扩增出目的条带。重组质粒可在宿主菌中高效表达,经镍柱亲和层析得到相对分子质量为43kD的重组蛋白。结论本实验成功获得S.suis 2MCP蛋白,为研究其在猪链球菌2型致病过程中发挥的作用奠定了基础。
- 郭静静杜骁杰刘文静郑峰胡丹王长军潘秀珍
- 关键词：猪链球菌2型MCP原核表达
- 猪链球菌真核样丝氨酸/苏氨酸激酶stk基因功能的实验研究
- 猪链球菌（Streptococcus suis,S.suis）是一种重要的人兽共患病病原菌,根据其表面荚膜多糖（Capsular polysaccharide, CPS）的抗原性,可以分为1/2、1-31和33共33个血...
- 杜骁杰
- 关键词：2型猪链球菌
- 文献传递
- 2型猪链球菌丝氨酸/苏氨酸磷酸酶重组蛋白的制备及鉴定被引量：2
- 2014年
- 目的链球菌丝氨酸/苏氨酸磷酸酶(serine/threonine phosphotase,STP)是重要的磷酸化信号调控系统成员之一。文中对2型猪链球菌(Streptococcus suis serotype 2,S.suis 2)STP编码基因stp进行原核表达并对纯化蛋白进行酶活测定。方法对S.suis 2 stp进行生物信息学分析,PCR扩增stp基因片段,构建重组表达载体pET28a::stp。将载体转入E.coli BL21中,经IPTG诱导,Ni2+亲和层析柱纯化重组蛋白,SDS-PAGE和Western blot鉴定,利用磷酸对硝基苯酯(p-nitrophenyl phosphate,pNPP)为底物测定其水解量进而鉴定磷酸酶活性。结果从05ZYH33基因组中PCR扩增到810 bp的片段,经连接获得重组表达载体pET28a::stp;经诱导表达及纯化获得相对分子质量为32000的重组蛋白,该蛋白在Mn2+存在下能够水解pNpp。结论获得纯度较高的STP重组蛋白,该蛋白具有Mn2+依赖的磷酸酶活性,为后续阐明STK/STP磷酸化系统的调控机制打下基础。
- 杜骁杰郭静静王晶李敏王玲王长军潘秀珍
- 关键词：2型猪链球菌
- 染色质免疫共沉淀法对猪链球菌反应调控因子CovR靶基因的筛选被引量：2
- 2013年
- 目的猪链球菌CovR是具有全局调控作用的负反应调控因子。文章采用染色质免疫共沉淀(chromatin immu-noprecipitation,ChIP)方法筛选转录调控因子CovR的靶基因,为进一步开展CovR调控机理研究提供条件。方法利用甲醛固定猪链球菌2型05ZYH33菌株活细胞,超声波破碎法将DNA随机断裂成100～500bp大小不同的片段,再利用CovR特异性单抗免疫沉淀该蛋白质-DNA片段解交联并分离纯化DNA。针对8个潜在的靶标基因启动子区设计引物,分别用设计的引物对免疫共沉淀的DNA样品进行PCR扩增,验证CovR与DNA的结合。结果最佳ChIP实验条件为1%甲醛交联DNA与蛋白质的复合物;功率80 W、工作10 s、间隔30 s、超声40次破碎该复合物,可得到100～500 bp大小不同的片段用于后续实验。PCR结果显示SSU1668基因和SSU1732基因启动子区扩增出阳性条带,另外6种基因的启动子区未扩增出阳性条带。结论 CovR抗体免疫沉淀得到的DNA片段中含有SSU1668基因和SSU1732基因启动子区,表明SSU1668基因和SSU1732基因是CovR的靶基因。
- 郭静静王玲杜骁杰李敏王晶李先富郑峰胡丹王长军潘秀珍
- 关键词：猪链球菌2型
- 2型猪链球菌表面蛋白Sao的生物信息学分析及基因工程疫苗的设计被引量：11
- 2014年
- 目的利用生物信息学方法分析Sao蛋白结构并预测B细胞抗原表位,筛选可用于疫苗设计的序列。方法以Sao蛋白的氨基酸序列为基础,利用Protparam工具分析蛋白基本理化性质,TMHMM预测跨膜区,PredictProtein在线分析蛋白二级结构,SWISS-MODEL软件模拟三级空间构象,DNASTAR分析亲(疏)水性、可塑性和表面可及性,综合使用在线ABCPred和BepiPred工具预测B细胞抗原表位,筛选能用于构建基因工程疫苗的蛋白序列。结果 Sao蛋白羧基端存在7个高度一致的重复序列以及1个LPVTG保守膜锚定基序,二级结构组分中无规卷曲比例高达74.21%,三级空间构象模拟结果与二级结构预测一致。蛋白的亲水区域、可塑性区域、表面可及性区域比例分别为76.21%、64.06%和75.04%。Sao存在多个线性抗原表位,经筛选得到两个可用于疫苗设计的蛋白序列,BLAST显示这两个序列为猪链球菌所特有,存在于2型猪链球菌9种不同的分离菌株中,同时也存在于猪链球菌致病性血清型1、2、1/2、3、7、9、14型中。结论 Sao蛋白为不稳定蛋白,亲水性强,筛选得到的两个蛋白序列抗原性强且高度保守,为猪链球菌特有序列,能够用于基因工程疫苗的构建。
- 王晶李敏杜骁杰王玲李先富王长军高基民潘秀珍
- 关键词：2型猪链球菌抗原表位预测疫苗
- 2型猪链球菌丝氨酸/苏氨酸激酶对细菌生物学特性的影响被引量：3
- 2014年
- 猪链球菌是一种重要的人兽共患病病原菌,有33个血清型[1].2型猪链球菌致病力最强,可引起脑膜炎、关节炎、败血症等[2].信号转导系统对细菌应对外界复杂的环境变化有着重要的作用.本课题组前期在对2型猪链球菌中国强毒株05ZYH33基因组测序的研究中发现和真核生物同源的丝氨酸/苏氨酸激酶stk,利用同源重组原理成功构建了stk基因敲除突变株[3],本文进一步研究stk缺失后细菌生物学特性的变化.
- 杜骁杰倪华王玲郑峰胡丹王长军潘秀珍
- 关键词：生物学特性苏氨酸激酶猪链球菌细菌信号转导系统人兽共患病
- 猪链球菌2型中国强毒株05ZYH33 ofs基因敲除突变株构建及其生物学特性研究被引量：1
- 2014年
- 目的探究猪链球菌血清浑浊因子ofs基因在强致病性2型猪链球菌致病过程中的作用。方法利用同源重组基因敲除方法构建中间为壮观霉素抗性基因,两侧为ofs编码基因上、下游同源序列的基因敲除质粒,将构建好的质粒电转化入猪链球菌感受态,同源重组筛选ofs基因敲除突变株,通过组合PCR、Southern杂交和DNA测序对疑似突变株进行验证。生物学功能实验研究比较ofs突变株和野生株05ZYH33在革兰氏染色、菌落溶血活性、生长速率和毒力等方面的差异。结果组合PCR、Southern杂交和DNA测序结果均证实ofs基因敲除突变株05ZYH33Δofs构建成功,体外实验结果显示ofs基因缺失后菌株在革兰氏染色和菌落溶血活性及形态、生长速率等方面未发生改变,但小鼠毒力实验数据结果表明敲除突变株Δofs的毒力降低。结论猪链球菌2型ofs基因与细菌的毒力相关,本实验构建的突变株05ZYH33Δofs为进一步研究猪链球菌2型的致病机理奠定基础。
- 李敏王晶史沛举郭静静杜骁杰李先富王长军潘秀珍高基民
- 关键词：猪链球菌2型基因敲除生物特性毒力
