黄欣梅
- 作品数：115 被引量：236H指数：7
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- 相关领域：农业科学生物学医药卫生轻工技术与工程更多>>
- 一步法SYBR Green实时定量RT-PCR检测坦布苏病毒方法的建立被引量：7
- 2015年
- 为建立快速检测坦布苏病毒（Tembusu virus，TMUV）的一步法SYBRGreen实时定量RT-PCR方法，本研究根据TMUVNS2A基因的保守序列，设计并合成了1对特异性引物，以体外转录的NS2A基因作为标准品，采用一步法实时定量RT-PCR方法检测TMUV。结果显示该方法标准曲线的决定系数为0．997，具有良好的线性关系；灵敏度为1ul10拷贝，是常规RT-PCR方法的100倍；并且与其他病毒无交叉反应，批内和批间变异系数分别为0．11％～0．30％和0．88％～1．31％，具有良好的特异性和稳定性。该方法对于TMUV人工感染鸭泄殖腔棉拭子的检测阳性率为100％，而常规RT-PCR检测的阳性率只有71％。因此，本研究所建立的一步法实时定量RT-PCR方法灵敏度高、重复性、特异性好，可以用于TMUV的临床检测。
- 刘青涛李银赵冬敏刘宇卓黄欣梅杨婧韩凯凯安凤娇
- 关键词：实时定量RT-PCR
- 鸡柔嫩艾美耳球虫免疫调节型DNA疫苗pVAX1.0-5401-IFN-γ的研究
- 鸡球虫病是严重危害养禽业发展的重要疾病之一，传统的防制办法还存在许多问题。DNA疫苗是一种新的生物技术疫苗，具有可靠的安全性、高稳定性、能诱导机体产生全面的免疫应答等优点。5401基因是EtMIC4基因序列的一部分，编码...
- 黄欣梅
- 关键词：IFN-Γ基因DNA疫苗鸡球虫病
- 文献传递
- 鸡γ-干扰素基因的克隆、序列分析及原核表达
- 应用RT-PCR方法,以ConA体外刺激培养6 h的鸡脾脏淋巴细胞(SP)总RNA为模板,成功扩增出鸡γ-干扰素cDNA基因,并克隆入pMD18-T载体,序列测定结果显示其阅读框(ORF)为492bp,与 GenBank...
- 严若峰黄欣梅徐立新李祥瑞
- 关键词：Γ-干扰素基因原核表达
- 文献传递
- 鹅黄病毒囊膜蛋白的原核表达及抗原性分析被引量：3
- 2012年
- 选取鹅黄病毒囊膜蛋白(E蛋白)基因进行克隆、表达和纯化,以获得能应用于血清学诊断和可作为亚单位疫苗的重组蛋白。根据鹅黄病毒JS804株全基因序列设计了1对引物,采用RT-PCR方法扩增出了鹅黄病毒的E基因,将其克隆到表达载体pET32a(+)中,构建了重组表达质粒pET32a-E,转化大肠杆菌BL21(DE3),并用IPTG进行诱导表达。结果表明,鹅黄病毒E基因在大肠杆菌中获得高效表达,融合蛋白分子量约为70 kDa,主要以包涵体形式存在于菌体中。Western Blot和间接免疫荧光试验发现,重组E蛋白具有较好的反应原性和良好的免疫原性。鹅黄病毒E蛋白的原核表达为进一步研究该蛋白功能、建立血清学检测方法及研制亚单位疫苗奠定了基础。
- 黄欣梅李银赵冬敏刘宇卓张敬峰韩凯凯钮慧敏
- 关键词：E蛋白原核表达抗原性
- 鸭坦布苏病毒RNA依赖RNA聚合酶的真核表达及生物信息学分析
- 2021年
- 旨在对鸭坦布苏病毒NS5蛋白功能基团RNA依赖RNA聚合酶进行真核表达,同时对其蛋白结构和功能进行生物信息学分析。首先查找GenBank数据库中收录的DTMUV基因序列,以RdRp基因为研究对象,通过软件设计并合成特异性引物,RT-PCR技术扩增RdRp基因,回收PCR产物并与pCMV-N-Flag真核表达载体相连接,构建真核表达质粒pCMV-Flag-RdRp,将测序无误的质粒转染至BHK-21细胞,通过Western Blot和间接免疫荧光技术检测该蛋白在BHK-21细胞内的表达。同时针对RdRp蛋白,利用生物信息学软件进行序列分析、结构解析及功能预测。通过PCR方法成功扩增RdRp基因,构建的真核表达质粒pCMV-Flag-RdRp经双酶切鉴定证明正确,进一步通过间接免疫荧光技术与Western Blot检测发现,重组质粒pCMV-Flag-RdRp在BHK-21细胞内正常表达,生物信息学分析发现,RdRp蛋白编码606个氨基酸,分子式为C_(3091)H_(4810)N_(870)O_(894)S_(41),编码蛋白亲水性平均系数为-0.536,不稳定指数为42.15,含有丰富的磷酸化位点及O-糖基化位点。其二级结构包含46.37%的α-螺旋、12.54%的延伸链以及35.31%的无规则卷曲。上述结果为进一步研究坦布苏病毒致病性打下了基础。
- 韩凯凯严若峰严若峰刘宇卓刘青涛刘宇卓李银章丽娇赵冬敏付晨
- 关键词：生物信息学
- 一种H9N2亚型禽流感灭活疫苗的生产方法及其制品
- 本发明公开了一种H9N2亚型禽流感灭活疫苗的生产方法及其制品，属于H9N2亚型禽流感灭活疫苗的生产及应用领域。本发明公开了一种H9N2亚型禽流感灭活疫苗的生产方法，包括：(1)利用细胞工厂培养MDCK细胞；(2)接种H9...
- 李银刘宇卓李彥伟滕颖黄欣梅赵冬敏韩凯凯杨婧
- 文献传递
- 鸭坦布苏病毒甲基转移酶的真核表达及鉴定
- 2021年
- 甲基转移酶(methyltransferase,MTase)是鸭坦布苏病毒(duck Tembusu virus,DTMUV)非结构蛋白5的重要功能基团,在病毒复制及致病过程中发挥重要作用。为了对鸭坦布苏病毒甲基转移酶进行真核表达,并对其生物学功能进行鉴定,以GenBank中收录的DTMUV JS804株基因序列为模板,设计针对MTase的特异性引物,提取TMUV RNA,反转录得到cDNA,以其为模板进行扩增,得到MTase的基因片段,然后亚克隆至pCMV-Flag真核表达载体中,构建重组质粒pCMV-Flag-MTase,提取去除内毒素的重组质粒,并转染至BHK-21细胞,通过间接免疫荧光观察和Western Blot鉴定该蛋白的表达。结果显示,质粒pCMV-Flag-MTase经双酶切鉴定证明构建正确,通过间接免疫荧光与Western Blot检测,重组质粒在BHK-21细胞内正常表达,表达的蛋白与天然坦布苏病毒MTase具有相同的反应原性。
- 韩凯凯严若峰严若峰刘宇卓刘青涛刘宇卓李银杨婧
- 关键词：甲基转移酶真核表达
- 坦布苏病毒感染DF-1细胞入侵途径的初步研究被引量：1
- 2021年
- 坦布苏病毒是我国新发易引起家禽出现严重产蛋下降和中枢神经系统异常的重要传染病病原。通过特异性的化学阻断剂预处理DF-1细胞,噬斑计数法检测其对病毒滴度的影响,相对荧光定量RT-PCR检测其对病毒核酸表达的影响,并对影响显著的结果进行吸附和内吞试验。结果显示,网格蛋白抑制剂氯丙嗪和动力蛋白抑制剂dynasore可显著降低病毒滴度和病毒核酸表达,且主要作用于内吞过程,对病毒吸附无影响。胆固醇抽提剂甲基-β-环糊精、小窝蛋白抑制剂genistein及胞吞抑制剂EIPA对病毒滴度无明显影响。结果表明,坦布苏病毒入侵DF-1细胞依赖于网格蛋白和动力蛋白,而不依赖于胆固醇、小窝蛋白和胞吞作用。
- 章丽娇李银刘青涛刘宇卓韩凯凯赵冬敏黄欣梅杨婧
- 关键词：入侵
- 鸭圆环病毒ORF-C1基因的扩增及遗传进化分析
- 2023年
- 鸭圆环病毒(DuCV)感染能够引起鸭的免疫抑制,引起多种病原的继发性感染,在我国鸭群中广泛流行。为了解DuCV的遗传变异情况,对采自山东、江苏和贵州3个省份的19个鸭场的样品进行了PCR测定,并对DuCV的ORF-C1基因进行测序和遗传进化分析。PCR测定结果显示,19个鸭场中有9个鸭场的样品为DuCV阳性,总体阳性率为47.4%;ORF-C1基因序列测定结果显示,9株DuCV之间的核苷酸序列和氨基酸序列同源性分别为93.4%~100%和82.2%~100%,与NCBI中已公布的DuCV毒株的核苷酸序列和氨基酸序列同源性分别为77.8%~99.5%和71.5%~-99.6%;遗传进化分析显示,9株DuCV全部属于DuCV-1b亚型,其中有7株在同一分支上,与D11-JW-001等韩国毒株遗传距离较近,另外2株则与山东、广西的毒株遗传距离较近;此外,与已公布的毒株相比,9株DuCV都在158位发生了氨基酸突变,由E/D变为L/P。上述结果表明,DuCV-1仍然为我国鸭群中的优势流行基因型,但病毒的基因也在不断地发生变异,应该对其进行持续监测。
- 吕振环赵莎卢凤英杨婧韩凯凯黄欣梅赵冬敏章丽娇吴凤瑶刘宇卓李银刘青涛张小飞
- 关键词：鸭圆环病毒遗传进化分析
- 鸡源坦布苏病毒(SN01株)的分离与鉴定被引量：5
- 2013年
- 采用SPF鸡胚与vero细胞传代接种法,从江苏某蛋鸡场临床表现为产蛋下降、卵泡萎缩、全身多器官出血为主要特征的发病鸡肝脏、卵巢病料组织中分离一株病毒。该分离毒不能凝集鸡和鹅红细胞,并对乙醚、氯仿敏感;病毒核酸为RNA;PCR结果排除了分离毒为禽流感病毒、新城疫病毒、产蛋下降综合征病毒、传染性支气管炎病毒、传染性喉气管炎病毒;用坦布苏病毒特异引物扩增为阳性,序列测定与分析结果显示分离毒与GenBank上登录和实验室保存的坦布苏病毒E基因序列同源性在99%以上。上述结果表明分离毒(SN01)可能是一种新的坦布苏病毒,属于黄病毒科坦布苏病毒属,暂称为鸡源坦布苏病毒。
- 张敬峰李银赵冬敏黄欣梅刘宇卓钮惠敏
