赵冬敏
- 作品数：112 被引量：326H指数：8
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- 相关领域：农业科学生物学医药卫生轻工技术与工程更多>>
- 一种同时表达FAdV-4纤突蛋白1与纤突蛋白2基因的DNA疫苗及其构建方法和应用
- 本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种同时表达FAdV‑4纤突蛋白1与纤突蛋白2基因的DNA疫苗及其构建方法和应用。本发明设计特异性引物，利用重叠PCR扩增技术，将FAdV‑4的纤突蛋白1与纤突蛋白2基因通过2A肽基因...
- 刘青涛李银杨婧黄欣梅赵冬敏韩凯凯刘宇卓章丽娇
- 文献传递
- 坦布苏病毒感染诱导雏鸭体内未折叠蛋白反应被引量：1
- 2021年
- 【目的】检测坦布苏病毒在雏鸭体内诱导未折叠蛋白反应的信号通路(PERK、IRE1和ATF6),为揭示坦布苏病毒致病机制提供理论基础。【方法】取1日龄SPF雏鸭,腹腔接种坦布苏病毒(JS804株),于接种后12、24、36和48 h从对照组和攻毒组各取5只剖杀,分别取肝脏、心脏和脑组织,利用组织总RNA提取试剂盒提取各个组织样品总RNA,反转录获得cDNA。根据未折叠蛋白反应的3条信号通路,选取不同通路中的标志性分子,设计合成特异性引物,利用荧光定量PCR方法检测靶基因。以GAPDH为内参基因,采用相对定量法(2-ΔΔCt),分析靶基因的表达水平。【结果】雏鸭肝脏中坦布苏病毒含量最高,心脏次之,脑最低。对未折叠蛋白反应标志性分子GRP78的检测结果显示,脑和肝脏中GRP78表达量持续升高,并在攻毒后36 h达到顶峰(4.21倍和10.14倍),心脏中GRP78表达量仅在攻毒后36 h短暂升高(1.32倍)。PERK信号通路标志性分子ATF4表达水平在肝脏和脑中分别从攻毒后24 h和36 h持续升高至攻毒后48 h,并在攻毒后36 h达到顶峰(2.71倍和6.02倍),心脏中ATF4的表达量则仅在攻毒后36 h时升高(1.57倍)。IRE1信号通路标志性分子XBP1s在肝脏中的表达量升高最为显著(9倍),而脑中EDEM的表达量升高最为显著(3.87倍)且持续时间最长(从攻毒后12 h至攻毒后48 h)。与对照组相比,ATF6信号通路标志性分子GRP94和XBP1u均出现升高现象,虽然两种蛋白在不同组织中表达量变化的时间点和趋势不同,但均在攻毒后36 h出现峰值。【结论】首次报道了坦布苏病毒感染可在雏鸭体内激活未折叠蛋白反应的3条信号通路,本研究将有助于深入研究坦布苏病毒与宿主之间的相互作用机制。
- 赵冬敏黄欣梅章丽娇刘青涛杨婧韩凯凯刘宇卓李银
- 关键词：内质网应激未折叠蛋白反应信号通路
- 鹅坦布苏病毒E蛋白质结构域I和Ⅱ在大肠杆菌中的表达及鉴定被引量：1
- 2014年
- 为了实现鹅坦布苏病毒E蛋白质结构域I和II在大肠杆菌中的表达。利用PCR方法扩增得到目的片段,并引入FLAG标签序列(DYKDDDDK),构建重组表达质粒pET28a-E-I/II。转化至BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达目的蛋白质,并对其进行SDS-PAGE分析和Western-blot鉴定。结果显示,PCR扩增得到约900 bp的目的片段,经鉴定成功构建重组表达载体pET28a-E-I/II。重组菌在IPTG诱导4 h后在37 000处出现目的蛋白质并且表达量达到高峰。经超声波破碎后SDS-PAGE分析显示,融合蛋白质以包涵体形式存在。Western-blot结果显示,重组蛋白质与FLAG单抗和E蛋白质阳性血清均可发生特异性反应。表明鹅坦布苏病毒E蛋白质结构域Ⅰ和Ⅱ在大肠杆菌中成功表达,经鉴定重组蛋白质具有良好的免疫反应性。
- 赵冬敏黄欣梅刘宇卓韩凯凯谢星星刘晓燕李银
- 关键词：大肠杆菌DOMAINS
- 坦布苏病毒囊膜蛋白诱导的小鼠免疫应答
- 2017年
- 为了研究坦布苏病毒囊膜蛋白(E蛋白)的免疫原性,利用大肠杆菌表达系统高效表达坦布苏病毒囊膜蛋白(E蛋白)并对其诱导小鼠免疫应答进行了研究。结果表明,E蛋白免疫BALB/c小鼠后,免疫组小鼠血清中抗体效价均可达1∶51 200以上;同时,E蛋白可显著诱导血清中细胞因子IL-2、TNF-α和IFN-γ的表达,免疫组小鼠血清中IL-2、TNF-α的含量均极显著高于对照组(P<0.01),IFN-γ含量则显著高于对照组(P<0.05);此外,与对照组相比,E蛋白还可极显著刺激小鼠脾脏淋巴细胞的增殖,上述结果表明,E蛋白免疫后,小鼠机体可产生显著的体液免疫和细胞免疫反应。攻毒保护性试验结果显示,攻毒后,经荧光定量RT-PCR检测,E蛋白免疫组小鼠脑、肝脏、脾脏、卵巢、肾脏中坦布苏病毒载量均显著低于对照组,表明免疫E蛋白可有效抑制坦布苏病毒在小鼠各个组织中的增殖。结果表明,大肠杆菌表达的坦布苏病毒E蛋白可作为坦布苏病毒亚单位疫苗的候选抗原,为进一步预防和控制坦布苏病毒病奠定理论基础。
- 赵冬敏黄欣梅韩凯凯刘宇卓杨婧刘青涛毕可然李银
- 关键词：囊膜蛋白免疫应答亚单位疫苗
- 一步法SYBR Green实时定量RT-PCR检测坦布苏病毒方法的建立被引量：7
- 2015年
- 为建立快速检测坦布苏病毒（Tembusu virus，TMUV）的一步法SYBRGreen实时定量RT-PCR方法，本研究根据TMUVNS2A基因的保守序列，设计并合成了1对特异性引物，以体外转录的NS2A基因作为标准品，采用一步法实时定量RT-PCR方法检测TMUV。结果显示该方法标准曲线的决定系数为0．997，具有良好的线性关系；灵敏度为1ul10拷贝，是常规RT-PCR方法的100倍；并且与其他病毒无交叉反应，批内和批间变异系数分别为0．11％～0．30％和0．88％～1．31％，具有良好的特异性和稳定性。该方法对于TMUV人工感染鸭泄殖腔棉拭子的检测阳性率为100％，而常规RT-PCR检测的阳性率只有71％。因此，本研究所建立的一步法实时定量RT-PCR方法灵敏度高、重复性、特异性好，可以用于TMUV的临床检测。
- 刘青涛李银赵冬敏刘宇卓黄欣梅杨婧韩凯凯安凤娇
- 关键词：实时定量RT-PCR
- 鸭坦布苏病毒病-H9亚型禽流感二联灭活疫苗免疫佐剂筛选被引量：3
- 2021年
- 为筛选出理想的鸭TMUV-AIV(H9亚型)二联灭活疫苗免疫佐剂,将灭活的坦布苏病毒液和禽流感病毒(H9亚型)尿囊液分别与白油佐剂、卡波姆佐剂、铝胶佐剂、蜂胶佐剂制成抗原含量相同的TMUV-AIV二联灭活疫苗。应用阻断ELISA方法和血凝抑制方法测定免疫鸭血清中坦布苏病毒和禽流感病毒抗体,比较不同佐剂疫苗对试验鸭的免疫效力。结果表明,以白油作为佐剂的灭活疫苗组免疫效果最好,抗体产生快、抗体水平优于其他各组,免疫2周后60%(6/10)血清样品HI抗体可达1∶8以上,80%血清样品呈TMUV抗体阳性,是制备鸭TMUV-AIV(H9亚型)二联灭活疫苗的理想佐剂。
- 田宇杰嵇辛勤章丽娇刘青涛韩凯凯杨婧刘宇卓赵冬敏刘娜王梦瑶李银
- 关键词：灭活疫苗
- 鹅黄病毒囊膜蛋白的原核表达及抗原性分析被引量：3
- 2012年
- 选取鹅黄病毒囊膜蛋白(E蛋白)基因进行克隆、表达和纯化,以获得能应用于血清学诊断和可作为亚单位疫苗的重组蛋白。根据鹅黄病毒JS804株全基因序列设计了1对引物,采用RT-PCR方法扩增出了鹅黄病毒的E基因,将其克隆到表达载体pET32a(+)中,构建了重组表达质粒pET32a-E,转化大肠杆菌BL21(DE3),并用IPTG进行诱导表达。结果表明,鹅黄病毒E基因在大肠杆菌中获得高效表达,融合蛋白分子量约为70 kDa,主要以包涵体形式存在于菌体中。Western Blot和间接免疫荧光试验发现,重组E蛋白具有较好的反应原性和良好的免疫原性。鹅黄病毒E蛋白的原核表达为进一步研究该蛋白功能、建立血清学检测方法及研制亚单位疫苗奠定了基础。
- 黄欣梅李银赵冬敏刘宇卓张敬峰韩凯凯钮慧敏
- 关键词：E蛋白原核表达抗原性
- 鸭坦布苏病毒RNA依赖RNA聚合酶的真核表达及生物信息学分析
- 2021年
- 旨在对鸭坦布苏病毒NS5蛋白功能基团RNA依赖RNA聚合酶进行真核表达,同时对其蛋白结构和功能进行生物信息学分析。首先查找GenBank数据库中收录的DTMUV基因序列,以RdRp基因为研究对象,通过软件设计并合成特异性引物,RT-PCR技术扩增RdRp基因,回收PCR产物并与pCMV-N-Flag真核表达载体相连接,构建真核表达质粒pCMV-Flag-RdRp,将测序无误的质粒转染至BHK-21细胞,通过Western Blot和间接免疫荧光技术检测该蛋白在BHK-21细胞内的表达。同时针对RdRp蛋白,利用生物信息学软件进行序列分析、结构解析及功能预测。通过PCR方法成功扩增RdRp基因,构建的真核表达质粒pCMV-Flag-RdRp经双酶切鉴定证明正确,进一步通过间接免疫荧光技术与Western Blot检测发现,重组质粒pCMV-Flag-RdRp在BHK-21细胞内正常表达,生物信息学分析发现,RdRp蛋白编码606个氨基酸,分子式为C_(3091)H_(4810)N_(870)O_(894)S_(41),编码蛋白亲水性平均系数为-0.536,不稳定指数为42.15,含有丰富的磷酸化位点及O-糖基化位点。其二级结构包含46.37%的α-螺旋、12.54%的延伸链以及35.31%的无规则卷曲。上述结果为进一步研究坦布苏病毒致病性打下了基础。
- 韩凯凯严若峰严若峰刘宇卓刘青涛刘宇卓李银章丽娇赵冬敏付晨
- 关键词：生物信息学
- 一种H9N2亚型禽流感灭活疫苗的生产方法及其制品
- 本发明公开了一种H9N2亚型禽流感灭活疫苗的生产方法及其制品，属于H9N2亚型禽流感灭活疫苗的生产及应用领域。本发明公开了一种H9N2亚型禽流感灭活疫苗的生产方法，包括：(1)利用细胞工厂培养MDCK细胞；(2)接种H9...
- 李银刘宇卓李彥伟滕颖黄欣梅赵冬敏韩凯凯杨婧
- 文献传递
- 鸭坦布苏病毒甲基转移酶的真核表达及鉴定
- 2021年
- 甲基转移酶(methyltransferase,MTase)是鸭坦布苏病毒(duck Tembusu virus,DTMUV)非结构蛋白5的重要功能基团,在病毒复制及致病过程中发挥重要作用。为了对鸭坦布苏病毒甲基转移酶进行真核表达,并对其生物学功能进行鉴定,以GenBank中收录的DTMUV JS804株基因序列为模板,设计针对MTase的特异性引物,提取TMUV RNA,反转录得到cDNA,以其为模板进行扩增,得到MTase的基因片段,然后亚克隆至pCMV-Flag真核表达载体中,构建重组质粒pCMV-Flag-MTase,提取去除内毒素的重组质粒,并转染至BHK-21细胞,通过间接免疫荧光观察和Western Blot鉴定该蛋白的表达。结果显示,质粒pCMV-Flag-MTase经双酶切鉴定证明构建正确,通过间接免疫荧光与Western Blot检测,重组质粒在BHK-21细胞内正常表达,表达的蛋白与天然坦布苏病毒MTase具有相同的反应原性。
- 韩凯凯严若峰严若峰刘宇卓刘青涛刘宇卓李银杨婧
- 关键词：甲基转移酶真核表达
