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转录因子Sox2 SUMO修饰位点突变体的构建及真核表达: 2009年; 目的:构建Sox2及突变体Sox2 K247R的真核表达载体,并在293FT细胞中表达。方法:以含有Sox2基因全长的馈赠质粒为模板,用循环延伸PCR法得到该基因的突变体Sox2 K247R,并将野生型及突变型基因定向亚克隆到真核表达载体pCMV-HA上。得到的重组质粒经限制性内切酶消化和DNA测序鉴定。其后用脂质体包埋法将pCMV-HA-Sox2及pCMV-HA-Sox2 K247R分别单独转染或与pCMV-Myc-SUMO1共转染293FT细胞。采用Western blot分析蛋白表达情况及SUMO修饰情况。结果:经酶切和DNA序列测定,重组子序列正确,突变体第247位密码子由AAG转变为CGG。West-ern blot结果显示野生型及突变型的Sox2都在细胞内得到了很好的表达,SUMO修饰位点突变后,Sox2不能与SUMO蛋白结合。结论:Sox2野生型及突变型真核表达载体构建成功,在蛋白水平体现了SUMO修饰的差异性。; 郭泽坤吴先强单黎然宋振; 关键词：SOX2 SUMO 亚克隆定点突变真核表达

泛素样小蛋白4(SUMO4)的克隆、原核表达、纯化及鉴定被引量：10: 2008年; 【目的】为人类泛素样小蛋白4(SUMO4)多克隆抗体制备和疾病研究奠定基础。【方法】根据Gen-Bank提供的核酸序列,设计7条单链DNA,采用重叠延伸PCR方法,合成SUMO4基因编码区。基因片段经限制性内切酶双酶切,构建到表达载体pGEX-4T-1中。酶切、测序鉴定后,将重组子转染BL21 RIL菌株,表达及纯化融合蛋白。用SDS-PAGE和Western blot检测纯化效果,鉴定表达产物。【结果】成功合成了长度约为280 bp的SUMO4基因,经双酶切鉴定,SUMO4原核表达载体构建成功,插入片段测序正确。GST-SUMO4融合蛋白在终浓度1mmol/L IPTG、28℃诱导5 h后产量达到高峰,SDS-PAGE证实表达产物以可溶形式存在,分子量约为37 ku,GST亲和层析的纯化效果良好,Western blot验证融合蛋白分子量与预期值相符。【结论】SUMO4蛋白在大肠杆菌中高效表达,并以可溶性蛋白形式存在。; 单黎然杨振安宁宋振郭泽坤; 关键词：重叠延伸PCR 原核表达蛋白纯化

人SUMO-2基因原核表达、纯化及多克隆抗体制备被引量：1: 2008年; 目的:构建人SUMO-2基因的原核表达载体,纯化融合蛋白GST-SUMO2-SUMO2并以其为抗原免疫家兔,制备人SUMO-2多克隆抗体。方法:用PCR的方法得到人SUMO-2基因并克隆至pET41a(+)原核表达载体中,转化大肠杆菌BL21(DE3)plysS诱导融合蛋白GST-SUMO2-SUMO2表达;所获得的可溶性蛋白经亲和层析纯化、SDS-PAGE电泳鉴定后,免疫家兔制备抗血清,分别采用ELISA、Western blot检测抗体效价和特异性。结果:测序证实重组质粒pET41a(+)-SU-MO2-SUMO2构建成功;SDS-PAGE结果证实获得Mr为52000的GST-SUMO2-SUMO2融合蛋白且为可溶性蛋白;经过GST亲和层析有效纯化;以该融合蛋白免疫家兔制备得到的抗血清经Western blot检测证实能与目的蛋白发生特异性结合,ELISA检测为阳性。结论:获得了人SUMO-2蛋白及特异性多克隆抗体,对进一步研究人SUMO-2及SUMO第二类家族的功能提供了有用工具。; 杨振宋振安宁王劼郭霭光雷鸣郭泽坤; 关键词：原核表达蛋白纯化抗血清

人SUMO1基因的真核表达载体构建及其RNA干扰靶点筛选: 2010年; [目的]构建人SUMO1的真核表达载体,筛选SUMO1的有效干涉靶点。[方法]将SUMO1亚克隆至载体pCMV-HA中。寻找可能的干涉位点,合成上下游引物,退火后直接克隆入GFP-HU双启动子载体。用WesternBlot和细胞荧光的方法检测各载体对外源性SUMO融合蛋白表达的影响,其后检测对内源性SUMO1表达的敲降效果。[结果]构建的人SUMO1真核表达载体pCMV-HA-SUMO1测序正确。针对267、279、293、309、342、386等不同干涉靶点构建双启动子干扰载体,其中293位点的干涉载体在WesternBlot和荧光检测试验中均表现出稳定的敲降效果,抑制了SUMO1的表达。[结论]该研究成功构建了SUMO1的真核表达载体及具有明显敲降效果的干涉载体,可为后续研究奠定基础。; 吴勇延肖亮单黎然宋振郭泽坤; 关键词：RNA干涉

人SUMO-3基因原核表达及多克隆抗体制备被引量：2: 2008年; 构建人SUMO-3基因的原核表达载体pET41a(+)-SUMO-3,表达重组GST-SUMO-3融合蛋白,制备人SUMO-3多克隆抗体。试验结果显示,通过PCR方法从重组质粒pEYFP-SUMO-3中克隆到的SUMO-3N端93个氨基酸的基因序列与NCBI上提供的序列一致,重组质粒pET41a(+)-SUMO-3构建成功;重组pET41a(+)-SUMO-3在E.coli.BL21(DE3)pLysS中表达GST-SUMO-3融合蛋白,分子量为44.0 kDa,与预期分子量一致;采用亲和层析纯化融合蛋白GST-SUMO-3并免疫家兔,获得人SUMO-3抗体;Westernblot检测显示该抗体可以特异性识别SUMO-3,ELISA检测结果成阳性,抗体效价约为1∶20000。实验结果为进一步研究人SUMO-3及SUMO第二类家族的功能提供了有用工具。; 安宁杨振宋振雷鸣郭泽坤; 关键词：原核表达蛋白纯化多克隆抗体

人SUMO-1基因原核表达、纯化及多克隆抗体制备与鉴定被引量：6: 2009年; 目的构建人SUMO-1基因的原核表达载体,诱导表达重组蛋白,制备兔抗人SUMO-1抗血清。方法从质粒pcDNA-HA-SUMO1-GG中用PCR方法克隆到编码人SUMO-1N端97个氨基酸的基因片段,构建了SUMO-1原核表达载体pET41a(+)-SUMO1,转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,IPTG诱导蛋白表达并利用GST亲和层析柱进行纯化,以纯化后的融合蛋白GST-SUMO1为抗原免疫家兔,获得抗血清。Western blotting、ELISA法鉴定获得的抗血清。结果成功构建原核表达载体,纯化到融合蛋白GST-SUMO1,用纯化的融合蛋白免疫家兔制备了多克隆抗体,Western blotting、ELISA法证实多克隆抗体制备成功。结论成功获得了人SUMO-1多克隆抗体,为进一步研究人SUMO-1蛋白的功能奠定了基础。; 宋振王劼安宁杨振雷鸣郭泽坤; 关键词：原核表达蛋白纯化多克隆抗体

人SUMO-1蛋白多克隆抗体的制备与鉴定及亚细胞结构的定位: 目的：SUMO(small ubiquitin-related modifier小泛素相关修饰物)蛋白作为类似泛素的修饰蛋白逐渐成为了国际研究热点之一。本课题旨在构建人SUMO-1基因的原核和真核表达体系、制备SUMO-...; 宋振; 关键词：多克隆抗体亚细胞结构原核表达载体共定位脂质体转染法镜下观察; 文献传递

肌肉拉伸保存萎缩比目鱼肌Z线结构: ＜正＞Z线在保持肌节正常结构与传导力中发挥重要作用,然而,去负荷萎缩骨骼肌出现Z线变细与结果改变。因此,本实验的目的为探寻在骨骼肌去负荷过程中,能够防止Z线改变的对抗措施。采用尾部悬吊大鼠模型使后肢去负荷2周,同时采用石...; 徐彭涛陈焱宋振李全余志斌; 文献传递

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宋振