张中洋
- 作品数：19 被引量：41H指数：4
- 供职机构：北京生物制品研究所有限责任公司更多>>
- 发文基金：国家科技支撑计划国家高技术研究发展计划“重大新药创制”科技重大专项更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 人巨细胞病毒gB基因真核表达载体的构建与鉴定被引量：4
- 2004年
- 目的 克隆人巨细胞病毒 (HCMV)gB基因并构建真核表达载体。方法 根据Genebank中HCMV核苷酸序列设计引物 ,并在引物的 5′端分别加入BamHⅠ、XhoⅠ限制性内切酶位点 ,特异性扩增gB编码基因片段。TA克隆后经双酶切、PCR、测序等鉴定重组质粒 ,再经双酶切、连接构建含HCMVgB编码基因的真核表达载体 ,转染COS7细胞 ,通过间接免疫荧光法 (IFA)检测该重组真核表达载体在COS7细胞中的表达。结果 重组质粒经BamHⅠ、XhoⅠ双酶切成大小为 5 0kb与 2 7kb的片段 ,表明表达载体pcDNA3 1中插入了HCMVgB基因片段 ,测序结果表明读码框正确。重组表达载体pcDNA3 1 gB转染COS7细胞后 ,经IFA检测胞浆中可见黄绿色荧光。结论成功构建了pcDNA3 1 gB真核表达载体 。
- 许丽锋张中洋李秀玲何薇薇
- 关键词：人巨细胞病毒GB基因真核表达载体重组质粒
- 不同方法配制的DTaP—sIPV中sIPV的免疫原性研究被引量：1
- 2017年
- 目的 对采用不同配制方式制备的，含不同剂量Sabin株脊髓灰质炎（脊灰）灭活疫苗（Sabin strain inactivated poliovirus vaccine，sIPV）的DTaP-sIPV联合疫苗中sIPV的免疫原性进行研究。 方法 按照2种不同方式配制含高、低剂量sIPV的DTaP-sIPV联合疫苗。将70只大鼠按简单随机法分成7组，分别为F1H（DTaP-sIPV高剂量组，配制方式1）、F2H（DTaP-sIPV高剂量组，配制方式2）、sIPV-H（sIPV高剂量组）、F1L（DTaP-sIPV低剂量组，配制方式1）、F2L（DTaP-sIPV低剂量组，配制方式2）、sIPV-L（sIPV低剂量组）、赛诺菲巴斯德五联疫苗潘太欣组。每组10只大鼠，间隔3周双侧后腿肌内注射，0.5 ml/只，共免疫3针。于第0、3、6、9、13、17、21、25周眼眶采血、分离血清，采用微量细胞病变效应抑制法分别测定血清中抗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型脊灰病毒中和抗体滴度，并进行多样本均数方差分析。结果 每针免疫后，各组抗各型中和抗体滴度均持续上升，第9周均达到最高水平，第13周开始显著下降，至第25周仍维持在一定水平。3针免疫完成后3周，F2H组的抗Ⅰ型脊灰病毒中和抗体几何平均滴度显著高于潘太欣组（F=0.988，P=0.027）；抗Ⅱ型中和抗体，F2H组显著高于F1H组，sIPV-H组显著高于F1H和潘太欣组（F=2.391，P值均〈0.05）；抗Ⅲ型中和抗体，各组间差异均无统计学意义。3针基础免疫后各时间点F2H组抗各型中和抗体滴度均为最高，但除第9周其抗Ⅱ型中和抗体显著高于F1H组外，其他差异均无统计学意义。结论 DTaP-sIPV联合疫苗免疫大鼠后可以诱导产生抗各型中和抗体，且其滴度和持续时间均优于或等同于潘太欣组。DTaP-sIPV诱导的中和抗体滴度不低于相应剂量的sIPV。虽然配制方式2可能更佳，但2种配制方式间sIPV的免疫原性差异无统计学意义。
- 张中洋宋冬梅鲁卫卫张越刘善茹胡业勤艾绪露李秀玲
- 关键词：脊髓灰质炎病毒疫苗免疫原性
- 水痘-带状疱疹病毒VZV84-7株全基因序列测定及分析被引量：4
- 2010年
- 目的分析我国自行分离的水痘-带状疱疹病毒疫苗株北京株(VZV84-7株)的全基因序列及特征。方法采用超速离心法获得纯化病毒颗粒,酚-氯仿法抽提病毒基因组DNA后超声破碎,回收1500～3000bp的片段,克隆至质粒pUC18中,构建病毒DNA文库,进行测序及序列分析,并与Dumas野毒株进行比较,绘制种系发育树,分析其与其他株VZV的同源性。结果VZV84-7株基因组全长125083bp,G+C含量为46.1%。基因组各区段长度及G+C含量分别为:UL:104746bp,G+C:44.3%;TRL和IRL:各89bp,G+C:69.7%;Us:5235bp,G+C:42.8%;TRS和IRS:各7462bp,G+C:59.3%。其R2可变区重复单位的拷贝数为7个,R4可变区为9个,R5可变区为1个。VZV84-7株共有71个ORFs,其中3个基因位于重复序列区,位于IRS的ORF69～71与位于TRS的ORF62～64序列完全一致。与Dumas株相比,共有248个核苷酸位置存在差异,大部分突变为单个核苷酸替换,另有部分插入或缺失性突变。其中碱基转换比碱基颠换更常见,发生率分别为66%和34%。种系发育分析结果显示,VZV84-7株与其他株VZV的同源性为95%以上。结论VZV84-7株具有其独特的基因特征,但与其他株VZV具有较高的同源性。
- 李秀玲王潇潇张中洋郝春生张晨何薇薇
- 关键词：水痘-带状疱疹病毒基因
- 抗脊髓灰质炎病毒Ⅰ型D抗原单克隆抗体的制备及其初步应用被引量：2
- 2012年
- 目的制备脊髓灰质炎病毒(Poliovirus)Ⅰ型D抗原单克隆抗体,并建立双抗体夹心ELISA检测方法。方法采用Vero细胞培养脊髓灰质炎病毒Ⅰ型,柱层析纯化病毒抗原,SDS-PAGE鉴定病毒蛋白,HPLC分析抗原纯度,Western blot分析抗原的反应原性。以纯化的脊髓灰质炎病毒Ⅰ型D抗原免疫BALB/c小鼠,进行细胞融合,筛选可分泌脊髓灰质炎病毒I型D抗原单克隆抗体的杂交瘤细胞株。单克隆抗体经纯化后,采用间接ELISA法检测小鼠腹水抗体效价、单抗的特异性及相对亲和力。分别以纯化的单抗作为捕获抗体和酶标抗体,进行配对试验,建立用于脊髓灰质炎病毒Ⅰ型D抗原检测的双抗体夹心ELISA方法,确定方法的最佳线性范围,并验证方法的特异性。结果纯化的脊髓灰质炎病毒Ⅰ型D抗原经SDS-PAGE分析,共显示4条蛋白条带,相对分子质量分别为约40 000、35 000、32 000和28 000;经HLPC分析,纯度达99%;小鼠免疫血清可与相对分子质量约为35 000的VP1蛋白发生特异性反应。共筛选出5株可稳定分泌脊髓灰质炎病毒I型D抗原单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞株,纯化的单抗仅与D抗原发生反应;2H1和3B5株单抗的效价分别为2×107和2×106,且亲和力高于其他3株单抗。采用2H1和3B5株单抗配对,可以特异性检测D抗原,而与C抗原不反应;D抗原最佳线性范围为4.300～0.071 DU/ml,R2为0.994 6。该法仅可检出脊髓灰质炎病毒Ⅰ型D抗原,而与脊髓灰质炎病毒Ⅱ型、Ⅲ型D抗原和脊髓灰质炎病毒Ⅰ型C抗原、EV71抗原、Vero细胞培养上清不发生交叉反应。结论制备了脊髓灰质炎病毒Ⅰ型D抗原单克隆抗体,建立了可用于脊髓灰质炎病毒Ⅰ型D抗原特异性检测的双抗体夹心ELISA方法。
- 张中洋郭会杰赵敏杨永娟郝春生李懿马淑花刘宇宁海京张晨陈明田龙李秀玲
- 关键词：脊髓灰质炎病毒D抗原C抗原抗体单克隆酶联免疫吸附测定
- 肠病毒71型空斑检测方法的建立被引量：4
- 2009年
- 目的建立肠病毒71型(EV71)空斑检测方法,为EV71生物学特性及疫苗的研究提供手段。方法将不同稀释度的5株EV71分别接种至单层RD细胞和Vero细胞,加入甲基纤维素覆盖,计数空斑,并计算病毒滴度。通过3次连续检测,验证空斑法的精密性,并对空斑法与微量细胞病变法检测病毒滴度的结果进行比较。结果采用RD细胞和Vero细胞,通过空斑法对EV71病毒滴度进行检测,96h后均能规律地出现边缘整齐、清晰的空斑,RD细胞和Vero细胞检测的空斑直径分别为1～2mm和0.5～1mm。连续3次重复试验结果显示,试验间变异系数的平均值Vero细胞为2.52%,RD细胞为4.49%。空斑法与微量细胞病变法比较,其检测结果具有良好的线性相关性,相关系数为r=0.972,P=0.006。结论已建立了精密性好、出斑规律的EV71病毒空斑检测方法。
- 郝春生赵敏张晨何薇薇王潇潇杨永娟张中洋沈心亮李秀玲
- 关键词：肠病毒71型
- 我国水痘-带状疱疹病毒VZV84-7减毒株基因特征研究
- 目的:建立特异性鉴定水痘-带状疱疹病毒(VZV)毒株的方法,研究我国自行分离的VZV84-7减毒株(VZV84-7株)基因特征.方法:利用聚合酶链反应(PCR)技术分别扩增VZV84-7株和Oka株R2和R5可变区基因,...
- 李秀玲谢云何薇薇张中洋庞宇刘立新
- 关键词：水痘-带状疱疹病毒基因聚合酶链反应克隆
- 文献传递
- 建立膜抗原荧光抗体试验评价北京株冻干水痘疫苗免疫效果被引量：8
- 2005年
- 为了建立用于水痘疫苗接种后血清中特异性抗体检测的膜抗原荧光抗体(FAMA)法,并对接种水痘疫苗后儿童血清中水痘特异性抗体进行检测,评价北京株水痘疫苗的免疫效果。以水痘带状疱疹病毒(VZV)感染细胞作为抗原制备成固定抗原玻片,以异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗人IgG作为二抗建立FAMA法,并对该法的敏感性、特异性进行验证。运用此法对不同剂量北京株水痘疫苗接种后儿童血清中特异性抗体进行检测,分析儿童血清中水痘特异性抗体水平以及免后抗体阳转率,并与Oka株水痘疫苗进行比较。结果显示,FAMA法敏感性可达0.0196IU/ml,特异性好。应用此法检测300名观察者免前免后双份血清样本中抗VZVIgG,易感者中北京株水痘疫苗原苗(39810PFU/0.5ml)、2000PFU/0.5ml、500PFU/0.5ml接种组儿童血清免后抗体阳转率分别为100%、98.77%、85.42%,抗体几何平均滴度(GMT)分别为36.4、34.3、18.6,原苗与2000PFU间的抗体阳转率和GMT均无显著性差异(P>0.05),但原苗与500PFU、2000PFU与500PFU间的抗体阳转率和GMT均有显著性差异(P<0.05)。对照国产、进口Oka株水痘疫苗接种后抗体阳转率分别为95.35%、96.97%,抗体GMT分别为13.3、16.0,不同剂量北京株疫苗抗体阳转率与国产、进口Oka株疫苗相比,差别无显著性(P>0.05),但北京株疫苗原?
- 谢云李秀玲刘立新何薇薇张中洋张晨宋衍燕陈海平周铁群
- 关键词：水痘疫苗免疫效果
- 人乳头瘤病毒16型L1/E7嵌合基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达
- 2006年
- 目的 克隆人乳头状瘤病毒16型（HPV16）L1／E7嵌合蛋白基因，并在毕赤酵母中表达。方法 PCR扩增HPV16L1／E7基因，并克隆至毕赤酵母表达载体pPIC-3．5K和pPIC-9K中，构建含HPV16L1／E7基因的pPIC3．5K—HPV16L1／E7和pPIC9K—HPV16L1／E7重组表达载体，经测序证实插入的外源基因读码框正确后，分别转入GS115和KM71菌株中，筛选阳性转化菌株，经PCR鉴定，甲醇诱导表达HPV16L1／E7嵌合蛋白，经SDS—PAGE和Western blot鉴定，电镜观察，并经离心法纯化VLPs。结果 HPV16LI／E7基因已成功插入pPIC-3．5K和pPIC-9K载体中，共获得6株KM71HPV16L1／E7-pPIC3．5K、5铢GS115HPV16L1／E7-pPIC3．5K、1株KM71HPV16L1／E7-pPIC9K和2株GS115HPV16L1／E7-pPIC9K阳性转化菌株，并可表达相对分子质量约为69000的蛋白，与预期值一致。表达量约为0．35～1．04mg／ml。Western blot显示该蛋白可与抗-HPV16L1蛋白和抗-HPV16E7蛋白的单克隆抗体特异性结合。在透射电镜下可观察到VLPs的形成，其形态与HPV16天然病毒颗粒相似。经纯化的目的蛋白纯度接近100％。结论 已成功构建了pPIC3．5K—HPV16L1／E7和pPIC9K—HPV16L1／E7重组表达载体，阳性转化菌株可表达结构与野生型HPV16一致的VLPs。
- 宋衍燕李秀玲何薇薇张中洋许丽锋
- 关键词：人乳头瘤病毒毕赤酵母基因表达
- 不同CA16流行株的相关生物学和VP1基因的分子生物学研究被引量：3
- 2012年
- 目的对柯萨奇病毒A组16型（CA16）病毒株进行生物学特征与基因背景研究，为CA16病原和疫苗的进一步研究奠定基础。方法从咽拭子标本中分离出CA16病毒；通过中和鉴别试验和RT—PCR对病毒进行分子生物学鉴定；病毒的VPl基因序列测定后，与其他CA16序列进行比较，绘制种系发育树，确定病毒基因型；测定病毒滴度，观察病毒在Vero细胞上的噬斑形态；攻击乳鼠分析病毒的致病性。结果从手足口病患者咽拭子标本中分离到6株病毒，采用肠道病毒通用引物可以从病毒感染细胞中扩增出约150bp大小的目的产物带；采用CA16特异性引物可以从病毒感染细胞中扩增出210bp大小的目的产物带。而采用EV71特异性引物未见特异性扩增条带。噬斑分析发现，6株病毒在Vero细胞上接种96h后均能出现清晰的噬斑，其中BJ-3噬斑直径为4—5mm，BJ-5噬斑直径约为3mm，BJ-1、BJ-2、BJ4、BJ-6噬斑直径为1．5～2mm；除BJ-3噬斑边缘模糊外，其余5株噬斑边缘整齐。该6株病毒均可被人CA16抗体阳性血清中和。在Vero细胞上连续传5代，滴度均在7．0LgcCID50／ml左右。基于VPI基因序列的种系发育分析结果显示，BJ-2、BJ-4、BJ-5属于C1亚型，BJ-1、BJ-3、BJ-6属于C3亚型，该6株病毒核苷酸同源性达90％以上，氨基酸同源性达99％以上。乳鼠攻击试验结果显示，BJ-3和BJ-5攻击后第4～5天乳鼠开始发病，后肢出现明显的麻痹、瘫痪症状，至第6～7天全部死亡，正常对照组和其他病毒组直至攻击后第14天均无异常。结论不同CA16病毒株的生物学特性有所不同，基因背景相近，致病性明显不同，需进一步了解中国流行的CA16病毒株的致病特点，为疫苗的研发提供直接依据。
- 郝春生杨永娟宋衍燕李懿张中洋郭会杰赵敏支惠罗凤基李秀玲
- 关键词：流行株手足口病
- 三种类型CpG-ODN作为蛋白亚单位疫苗佐剂的比较研究被引量：4
- 2008年
- 目的比较A、B和C3种类型CpG-ODN在动物模型中的疫苗佐剂活性，为设计高活性的新型人用疫苗佐剂提供理论基础。方法用不同CpG-ODN刺激体外培养的小鼠脾细胞，检测上清中的IFN-γ和IgM，从而确定3种类型的CpG-ODN。以基因工程乙肝表面抗原（HBsAg）为模型抗原、不同类型CpG-ODN为佐剂免疫BALB／c小鼠，用间接ELISA法检测被免动物血清中抗原特异性IgG、IgG1和IgG2a抗体。结果小鼠免疫结果表明，与A1（OH），对照组相比，3种类型CpG-ODN均具有良好的疫苗佐剂活性，但B和c型CpG-ODN诱生的抗原特异性IgG和IgG2a抗体水平远高于A型CpG-ODN。虽然A型CpG-ODN也能够显著增强总抗体水平，但并不改变IgG1和IgG2a抗体亚型的比值。这与B和c型CpG-ODN能够极大地促进TH1类免疫应答并降低IgG1／IgG2a比值明显不同，提示不同类型CpG-ODN可能通过不同机制起到疫苗佐剂作用。结论不同类型CpG-ODN具有不同疫苗佐剂活性，B和C型CpG-ODN在小鼠体内的体液免疫佐剂效果优于A型CpG-ODN。
- 张中洋王潇潇郝春生郑晓霞卜令楠许洪林
- 关键词：CPG-ODN乙肝表面抗原佐剂
