目的:探讨含内质网驻留信号序列KDEL(Lys-Asp-Glu-Leu-COOH)及尿激酶型纤溶酶原激活物裂解位点(cleavage site of urokinase-typeplasminogen activator,uPAcs)的Lun-β靶向融合免疫毒素对非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)细胞的抑制活性。方法:RT-PCR法克隆Lun-β基因,引物延伸法构建Lun-β-KDEL-uPAcs融合基因,并亚克隆至原核表达载体pET-32a(+)中,转入大肠埃希菌后,诱导其表达融合蛋白Trx-EK-Lun-β-KDEL-uPAcs(简称TELKP),并纯化TELKP蛋白。用肠激酶(enterokinase,EK)切割TELKP后,纯化与回收靶向融合免疫毒素Lun-β-KDEL-uPAcs(简称LKP)。采用CCK-8、RT-PCR和蛋白质印迹等方法,体外检测毒素LKP经uPA酶裂解后释放的Lun-β对NSCLC细胞活性的抑制作用。结果:成功诱导重组载体pET-32a(+)/Lun-β-KDEL-uPAcs表达相对分子质量约4.88×104的含载体表达标签Trx的融合免疫毒素蛋白TELKP,EK酶切该蛋白获得含290个氨基酸、相对分子质量约3.18×104的靶向融合免疫毒素LKP。LKP经uPA酶体外裂解后能释放具肿瘤杀伤活性的细胞毒素小分子Lun-β,且后者的体外抗瘤效应呈剂量依赖性。结论:成功构建了Lun-β-KDEL-uPAcs融合基因及其原核表达载体,并获得相对分子质量约3.18×104的靶向融合免疫毒素LKP,该毒素经uPA酶体外裂解后能释放具杀瘤活性的Lun-β毒素小分子。
目的:探讨细胞因子诱导的杀伤(cytokine-induced killer,CIK)细胞的分泌因子对人肝癌干细胞(hepatic cancer stem cells,HCSCs)凋亡的影响。方法:采用无血清悬浮细胞培养法富集人肝癌细胞Hep G2获得HCSCs;用FCM法检测HCSCs表面标志物CD90及CD133的表达情况;通过对裸鼠致瘤能力的观察,鉴定HCSCs的致瘤性。以干扰素γ(interferonγ,IFNγ)、CD3单克隆抗体和重组人白细胞介素-2(recombinant human interleukin-2,rh IL-2)诱导肝癌患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)产生CIK细胞。采用Transwell小室将不同细胞密度的CIK细胞与HCSCs接种在同一培养体系内,分隔培养24与48h后,用FCM法检测HCSCs的凋亡情况。分别采用反转录聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)法和蛋白质印迹法检测凋亡相关基因caspase-3 m RNA与蛋白表达的变化。结果:富集培养获得的HCSCs表面高表达干细胞标志物CD90和CD133。裸鼠致瘤能力观察表明,该HCSCs具较强的致瘤性。凋亡检测结果提示,CIK细胞的分泌因子可诱导HCSCs的凋亡,与对照组相比,凋亡率差异有统计学意义(P<0.01)。对caspase-3 m RNA与蛋白的检测结果显示,CIK细胞的分泌因子可上调HCSCs中促凋亡相关基因m RNA及蛋白的表达。结论:CIK细胞的分泌因子可诱导HCSCs发生凋亡,这可能与上调其促凋亡相关基因caspase-3的表达有关。
目的检测肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)的相关抗原,并予以验证。方法分别提取15例HCC组织及其癌旁组织总蛋白。Western blot分别检测各总蛋白与其HCC患者自体血清的杂交情况。双向电泳(two-dimensional electrophoresis,2-DE)技术将15例混合总蛋白中的各蛋白进行分离与染色。图像分析法比对染色胶上HCC组织及其癌旁组织蛋白的表达差异,基质辅助激光解吸/电离飞行时间二级质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization-time-of-flight with two mass analyzers for tandem mass spectrometry,MALDI-TOF MS/MS)技术及生物信息学网络数据库分别对表达差异蛋白予以分析鉴定与检索匹配,免疫组织化学与Western blot分别检测该差异蛋白在人HCC组织及其癌旁组织中的变化情况。结果 2-DE染色胶图像分析比对结果显示,HCC及其癌旁组织蛋白表达差异斑点共90个,MALDI-TOF MS/MS与数据库对其中19个蛋白斑点分析鉴定与检索匹配发现15个蛋白表达上调,4个蛋白表达下调。免疫组织化学与Western blot检测结果显示,与对照比较,上调蛋白中的Dna J同源B亚家族成员11(dna J homolog subfamily B member 11,DNAJB11)在HCC组织中的表达明显增强,下调蛋白中的蛋白酶体亚基α3(proteasome subunit alpha type 3,PSMA3)在HCC组织中的表达则相反。结论人原发性肝癌相关抗原DNAJB11在HCC组织中的表达上调,PSMA3在HCC组织中的表达下调。
