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沉默DNAJB11基因对肝癌SMMC7721细胞增殖、周期与凋亡的影响被引量：1: 2017年; 目的:研究沉默DNAJ同源B亚家族成员11(DNAJ homolog subfamily B member 11,DNAJB 11)基因表达对人肝细胞癌SMMC7721细胞增殖、周期与凋亡的影响。方法:构建携带有针对DNAJB 11基因的DNAJB11-shRNA重组慢病毒载体pCDH-Puro/DNAJB11-shRNA,并制备重组慢病毒。将具有高效感染力的重组病毒感染SMMC7721细胞。CCK-8法检测被感染后SMMC7721细胞的增殖情况;分别采用实时荧光定量PCR法与蛋白质印迹法检测被感染后,SMMC7721细胞中DNAJB11、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)和促凋亡基因caspase-3 mRNA及其蛋白的表达;FCM法检测沉默DNAJB 11基因表达后对SMMC7721细胞的周期和凋亡的影响。结果:成功构建插入DNAJB11-shRNA的重组慢病毒载体pCDH-Puro/DNAJB11-shRNA。CCK-8法检测结果显示,感染携带有DNAJB11-shRNA重组慢病毒后,SMMC7721细胞的增殖被抑制(P<0.05);实时荧光定量PCR法与蛋白质印迹法检测结果证实,DNAJB11-shRNA能有效沉默SMMC7721细胞中DNAJB11 mRNA及其蛋白的表达(P值均<0.05);DNAJB 11基因沉默后,能明显上调caspase-3 mRNA及蛋白的表达水平,并下调PCNA mRNA及蛋白的表达水平(P值均<0.05)。FCM检测结果表明,沉默DNAJB 11基因的表达可将SMMC7721细胞阻滞于细胞周期的G1期,并能促进其凋亡,差异均有统计学意义(P值均<0.01)。结论:沉默DNAJB 11基因表达可抑制SMMC7721细胞的增殖并促进其凋亡,这可能与下调SMMC7721细胞中增殖相关蛋白PCNA的表达,上调凋亡相关蛋白caspase-3的表达有关。; 项颖李启英石洋张曼黄德鸿南映瑜杨涛肖春燕王莉张文军龚奕曾建挺张艳林; 关键词：细胞增殖

DC-CIK细胞对人肝癌HepG2细胞增殖、迁移的影响被引量：5: 2013年; 目的探讨经细胞因子从肝癌患者外周血贴壁单个核细胞(PBMCs)诱导的树突状细胞(DC)与杀伤细胞(CIK)对人肝癌HepG2细胞增殖、迁移的影响。方法用肝癌患者肝癌组织裂解物(肿瘤抗原)致敏经粒细胞巨噬细胞刺激因子(GM-CSF)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及白细胞介素-4(IL-4)等诱导该患者PBMCs产生的DC。用干扰素-γ(IFN-γ)、IL-2和人CD3单克隆抗体(human CD3monoclonal antibody,hCD3mAb)等诱导该PBMCs的悬浮细胞产生CIK细胞。用Tanswell培养小室将DC-CIK细胞与HepG2细胞在同一培养体系内经该小室膜分隔培养24、48h。CCK-8法检测HepG2细胞生长变化,并绘制其生长曲线;划痕实验检测其增殖、迁移能力。RT-PCR、Western blot分别检测其增殖细胞核抗原(PCNA)基因及其编码蛋白的表达。结果 CCK-8法检测显示,DC-CIK细胞对人HepG2细胞生长具显著杀伤作用,与对照组细胞比较,差异有统计学意义(P<0.01)。划痕实验、基因与蛋白水平检测表明,DC-CIK细胞可明显抑制该瘤细胞的增殖与迁移,能在基因与蛋白水平下调该瘤细胞PCNA的表达。结论 DC-CIK细胞可显著下调肝癌细胞的PCNA基因表达,明显抑制其增殖与迁移,以发挥其杀瘤作用。; 项颖李启英王莉黄德鸿唐显军张曼杨威吴仙宇郑晓东; 关键词：细胞增殖细胞运动 DC-CIK细胞肝癌HEPG2细胞

Luffin-β-KDEL-uPAcs融合毒素的构建及其抗胃癌SGC-7901细胞的活性研究: 2013年; 目的构建含尿激酶型纤溶酶原激活剂(urokinase plasminogen activator,uPA)裂解位点(uPAcs)和KDEL(Lys-Asp-Glu-Leu)驻留信号序列的丝瓜毒素(Luffin-β)基因的原核载体,表达并纯化其融合毒素蛋白Luffin-β-KDEL-uPAcs(LKP),并探讨融合毒素蛋白LKP抗胃癌SGC-7901细胞的活性。方法 RT-PCR两步法克隆Luffin-β基因,引物延伸法构建Luffin-β-KDEL-uPAcs融合基因并亚克隆至原核表达载体pET-32a(+)中,诱导其表达融合蛋白Trx-EK-Luffin-β-KDEL-uPAcs(TELKP)并纯化TELKP,肠激酶(enterokinase,EK)切割TELKP后,纯化与回收目的毒素蛋白LKP,SDS-PAGE对LKP蛋白予以检测鉴定,高效液相色谱法(HPLC)对其进行纯度检测。采用cell counting kit-8(CCK-8)、RT-PCR、West-ern blot等方法,体外检测毒素蛋白LKP经uPA酶裂解后释放Luffin-β的抗胃癌SGC-7901细胞的活性。结果成功诱导重组载体pET-32a(+)/Luffin-β-KDEL-uPAcs表达相对分子质量约48.8×103含载体表达标签(Trx)的融合免疫毒素TELKP,EK酶切该蛋白获含290个氨基酸,相对分子质量约31.8×103的目的蛋白LKP。SDS-PAGE检测鉴定表明,LKP蛋白与预期大小一致,其纯度达98.8%。CCK-8、RT-PCR、Western blot等法检测显示,LKP经uPA酶体外裂解可释放具杀瘤活性的Luffin-β小分子毒素。结论成功克隆到Luffin-β-KDEL-uPAcs融合基因,并将其构建于原核表达载体pET-32a(+)中,且诱导该载体表达了相对分子质量约31.8×103的融合毒素LKP。LKP毒素经uPA酶体外裂解能释放具杀瘤活性的Luffin-β小分子毒素。; 李启英项颖余维倩王莉黄德鸿唐显军张曼张文军杨涛肖春燕; 关键词：杀瘤活性

自体DC+CIK细胞联合化疗治疗晚期非小细胞肺癌的临床研究: 目的:探讨自体DC+CIK细胞联合化疗(DC+CIK-化疗)治疗晚期非小细胞肺癌(Non-small-cell lung cancer，NSCLC)的治疗效果。　　方法:将满足条件的168例晚期NSCLC患者中行DC+C...; 张曼; 关键词：非小细胞肺癌 DC细胞 CIK细胞化疗; 文献传递

Luffin-β靶向融合免疫毒素的构建、表达及对非小细胞肺癌的抑制作用被引量：1: 2013年; 目的:探讨含内质网驻留信号序列KDEL(Lys-Asp-Glu-Leu-COOH)及尿激酶型纤溶酶原激活物裂解位点(cleavage site of urokinase-typeplasminogen activator,uPAcs)的Lun-β靶向融合免疫毒素对非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)细胞的抑制活性。方法:RT-PCR法克隆Lun-β基因,引物延伸法构建Lun-β-KDEL-uPAcs融合基因,并亚克隆至原核表达载体pET-32a(+)中,转入大肠埃希菌后,诱导其表达融合蛋白Trx-EK-Lun-β-KDEL-uPAcs(简称TELKP),并纯化TELKP蛋白。用肠激酶(enterokinase,EK)切割TELKP后,纯化与回收靶向融合免疫毒素Lun-β-KDEL-uPAcs(简称LKP)。采用CCK-8、RT-PCR和蛋白质印迹等方法,体外检测毒素LKP经uPA酶裂解后释放的Lun-β对NSCLC细胞活性的抑制作用。结果:成功诱导重组载体pET-32a(+)/Lun-β-KDEL-uPAcs表达相对分子质量约4.88×104的含载体表达标签Trx的融合免疫毒素蛋白TELKP,EK酶切该蛋白获得含290个氨基酸、相对分子质量约3.18×104的靶向融合免疫毒素LKP。LKP经uPA酶体外裂解后能释放具肿瘤杀伤活性的细胞毒素小分子Lun-β,且后者的体外抗瘤效应呈剂量依赖性。结论:成功构建了Lun-β-KDEL-uPAcs融合基因及其原核表达载体,并获得相对分子质量约3.18×104的靶向融合免疫毒素LKP,该毒素经uPA酶体外裂解后能释放具杀瘤活性的Lun-β毒素小分子。; 项颖李启英王江红王莉黄德鸿唐显军张曼张文军杨涛肖春燕; 关键词：免疫毒素类重组融合蛋白质类尿纤溶酶原激活物

食管T细胞淋巴瘤合并食管鳞癌1例被引量：1: 2013年; 1 临床资料患者，男性，54岁。因进行性吞咽困难半年余，于2012年1月入我院诊治。既往无特殊病史。入院查体：KPS评90分；令身浅表淋巴结未扪及；心肺腹无阳性体征。实验室检查提示血清LDH升高（455．84U／L），余均在正常范围；上消化道钡餐造影发现：食管下段见长约4.9cm充盈缺损，局部食管管壁僵硬、蠕动消失，考虑食管癌可能。进一步行胃镜检查提示：距门齿33～37cm食管段见一新生物凸向腔内，其表面不平，; 张曼杨涛李启英黄海萍项颖; 关键词：食管肿瘤 T细胞淋巴瘤食管鳞癌

VEGF受体单抗与Luffin双靶融合毒素的构建及其对非小细胞肺癌细胞的抑制作用: 2013年; 目的构建含血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)受体单链抗体(KDRscFv)、尿激酶纤溶酶原激活剂(urokinase plasminogen activator,uPA)裂解位点(uPAcs)、丝瓜毒素(luffin-β)与KDEL(Lys-Asp-Glu-Leu)内质网驻留信号序列的双靶向融合毒素,并探讨其对非小细胞肺癌(non-small-cell lung carcinoma,NSCLC)细胞的抑制作用。方法全基因合成KDRscFv基因,RT-PCR法克隆luffin-β,重叠PCR法将两基因融合,其连接部位与C端分别引入uPA裂解位点uPAcs与KDEL,形成融合基因KDRscFv-uPAcs-Luffin-β-KDEL。将该融合基因克隆至原核表达载体pET-32a(+)中,转入大肠杆菌后,诱导其表达融合毒素蛋白Trx-EK-KDRscFv-uPAcs-Luffin-β-KDEL(TEKPLK)并纯化TEKPLK。用肠激酶(enterokinase,EK)切割TEKPLK后,纯化与回收靶向融合毒素KDRscFv-uPAcs-Luffin-β-KDEL(KPLK)。采用CCK-8(cell counting kit-8)、RT-PCR、Western blot等方法,体外检测靶向融合毒素KPLK经uPA酶裂解后释放Luffin-β对NSCLC细胞的抑制作用。结果成功诱导重组载体pET-32a(+)/KDRscFv-uPAcs-Luffin-β-KDEL表达相对分子质量约7.5×104含载体表达标签(Trx)的融合毒素蛋白TEKPLK,EK酶切该蛋白获得相对分子质量约5.8×104的靶向融合免疫毒素KPLK。CCK-8法检测表明,KPLK毒素的杀瘤活性成剂量-效应关系,其IC50约为35 ng/mL;RT-PCR和Western blot检测结果显示,KPLK经uPA酶体外裂解后能释放细胞毒素小分子Luffin-β,上调瘤细胞促凋亡基因caspase-3及其蛋白的表达。结论成功构建了KDRscFv-uPAcs-Luffin-β-KDEL融合基因及其原核表达载体,并获得相对分子质量约5.8×104的靶向融合毒素KPLK,该毒素经uPA酶体外裂解后能释放具杀瘤活性的Luffin-β毒素小分子。; 项颖黄德鸿唐显军王莉张曼张文军杨涛肖春燕王江红; 关键词：杀瘤活性

CIK细胞分泌因子对肝癌干细胞凋亡的影响被引量：1: 2015年; 目的:探讨细胞因子诱导的杀伤(cytokine-induced killer,CIK)细胞的分泌因子对人肝癌干细胞(hepatic cancer stem cells,HCSCs)凋亡的影响。方法:采用无血清悬浮细胞培养法富集人肝癌细胞Hep G2获得HCSCs;用FCM法检测HCSCs表面标志物CD90及CD133的表达情况;通过对裸鼠致瘤能力的观察,鉴定HCSCs的致瘤性。以干扰素γ(interferonγ,IFNγ)、CD3单克隆抗体和重组人白细胞介素-2(recombinant human interleukin-2,rh IL-2)诱导肝癌患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)产生CIK细胞。采用Transwell小室将不同细胞密度的CIK细胞与HCSCs接种在同一培养体系内,分隔培养24与48h后,用FCM法检测HCSCs的凋亡情况。分别采用反转录聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)法和蛋白质印迹法检测凋亡相关基因caspase-3 m RNA与蛋白表达的变化。结果:富集培养获得的HCSCs表面高表达干细胞标志物CD90和CD133。裸鼠致瘤能力观察表明,该HCSCs具较强的致瘤性。凋亡检测结果提示,CIK细胞的分泌因子可诱导HCSCs的凋亡,与对照组相比,凋亡率差异有统计学意义(P<0.01)。对caspase-3 m RNA与蛋白的检测结果显示,CIK细胞的分泌因子可上调HCSCs中促凋亡相关基因m RNA及蛋白的表达。结论:CIK细胞的分泌因子可诱导HCSCs发生凋亡,这可能与上调其促凋亡相关基因caspase-3的表达有关。; 杨涛张曼张文军王国碧黄德鸿唐显军王宏宇王刚王莉肖春燕杨建中项颖李启英; 关键词：肝细胞杀伤细胞细胞凋亡

DCs-CIK细胞免疫治疗联合化疗对晚期非小细胞肺癌疗效及安全性的影响被引量：30: 2014年; 目的:探讨树突状细胞(dendritic cells,DCs)-细胞因子诱导的杀伤(cytokine induced killer,CIK)细胞免疫治疗联合化疗对晚期非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)疗效及安全性的影响。方法:将272例晚期NSCLC患者随机分为治疗组(化疗联合DCs-CIK细胞免疫治疗组)和对照组(单纯化疗组)。比较2组治疗后的近期疗效,及治疗前后患者免疫功能和生活质量的变化,并分析DCs-CIK细胞免疫治疗的影响因素,观察其不良反应。结果:近期疗效分析结果显示,治疗组和对照组有效率分别为49.26%和37.50%(P>0.05),疾病控制率为68.38%和54.41%(P<0.05);2组患者治疗前后外周血中表面抗原CD3+、CD8+和自然杀伤细胞所占的比值,差异均有统计学意义(P<0.05);患者年龄、肿瘤分期和Karnofsky体能状况(Karnofsky performance status,KPS)评分是DCs-CIK细胞免疫治疗疗效的影响因素;治疗组患者生活质量优于对照组(P<0.05);行DCs-CIK细胞免疫治疗的患者中仅有15例患者出现低热,未见其他的不良反应。结论:DCs-CIK细胞免疫治疗联合化疗可以提高晚期NSCLC的疾病控制率,改善患者的免疫功能和生活质量;患者的年龄、KPS评分及肿瘤分期可影响其疗效。; 张曼杨涛石洋张文军李启英唐显军黄德鸿闫国和杨威吴仙宇王宏宇项颖; 关键词：免疫疗法树突细胞杀伤细胞

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张曼

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