目的分析大连市甲型肝炎(甲肝)病毒(Hepatitis A virus,HAV)流行株基因特征。方法采集大连市2020年部分甲肝病例急性期血清或粪便标本,提取HAV核酸,采用巢式RT-PCR扩增目的基因,构建HAV获得序列与GenBank中参考序列的系统进化树,分析HAV序列VP1-2A区核苷酸和氨基酸同源性,确定基因型。结果从甲肝病例标本中获得54条HAV序列,核苷酸、氨基酸同源性分别为97.15%-100%、98.13%-100%,属于ⅠA基因亚型。获得序列与中国内地序列中2014年辽宁省丹东市、2019-2020年山东省烟台市和威海市序列的核苷酸同源性最高,为98.42%-99.69%;与其他国家序列中日本、意大利HAV序列的核苷酸同源性最高,为99.07%-100%。在获得序列中,53条序列的氨基酸同源性为100%,1条序列与其存在2个氨基酸差异。结论大连市2020年HAV优势流行株为ⅠA基因亚型,甲肝可能具有多个传播链和相同感染来源。HAV基因型监测有助于HAV溯源和及时采取应对措施。
目的对牡蛎中戊型肝炎病毒(hepatitis E virus,HEV)检测方法进行比较,为牡蛎中HEV的检测提供技术参考。方法参考欧盟ISO/TS 15216-2∶2019,用蛋白酶K消化法对人工污染HEV粪便悬液的牡蛎消化腺标本进行前处理后,分别用四种核酸提取方法进行HEV RNA提取,通过Real time RT-PCR检测,比较HEV回收率;分别用蛋白酶K消化法、蛋白酶K消化+PEG沉淀法和蛋白酶K消化+PEG沉淀+氯仿抽提法对人工污染的牡蛎消化腺标本进行前处理,用最优核酸提取方法进行HEV RNA提取,通过Real time RT-PCR检测,比较三种前处理方法的HEV回收率和抑制率。将最优HEV检测方法应用于市售牡蛎标本检测。结果四种核酸提取方法的HEV回收率分别为1.37%,2.50%,4.24%和7.56%,差异有统计学意义(F=847.220,P<0.001);三种前处理方法的HEV回收率分别为6.02%,13.65%和21.17%,差异有统计学意义(F=16.800,P<0.001),蛋白酶K消化+PEG沉淀+氯仿抽提法回收率最高;三种方法的抑制率分别为13.38%,20.98%和8.66%,差异具有统计学意义(F=20.205,P<0.001),蛋白酶K消化+PEG沉淀+氯仿抽提法抑制率最低。在120份市售牡蛎标本中检出一份HEV RNA阳性标本。结论在对牡蛎标本进行HEV检测时,用蛋白酶K消化+PEG沉淀+氯仿抽提法进行前处理,能够提高牡蛎中HEV的回收率,更适用于牡蛎标本的前处理;不同厂家的病毒核酸提取方法的HEV回收率不同,开展检测前应比对筛选,择优使用。
目的为中国急性乙型病毒性肝炎(乙肝)监测,筛选合适的抗乙肝病毒核心抗原抗体免疫球蛋白M(Immunoglobulin M Antibody to Hepatitis B Virus Core Antigen,Anti-HBc-IgM)检测试剂。方法选择市场销量较大的三种酶联免疫吸附试验Anti-HBc-IgM检测试剂,平行检测参比系统各3次,比较各试剂的组内相关系数(Intraclass Correlation Coefficient,ICC)、变异系数,以评价试剂的可靠性,绘制受试者工作特征曲线(Receiver Operating Characteristic,ROC),计算ROC下面积(Area Under Curve,AUC)、部分(Partial)AUC(pAUC)、固定特异度下灵敏度[Sensitivity at a Fix Specificity,Se(FPR=e)],以评价试剂的真实性。结果三种试剂的ICC均接近于1,一致性均好,两两比较中A试剂稳定性最好,变异性最小(Bootstrap法,P<0.05)。B试剂ROC位于最上方,AUC中位数最大,和A、C比较均有统计学意义(Bootstrap法,P<0.05);B和C、A试剂的pAUC中位数和Se(FPR=0.05)中位数差异无统计学意义。结论符合国家标准的三种试剂,以雅培试剂作为参照相比,综合评价结果,B试剂较好。
为分析具有相同VP1-2A区基因序列的甲型肝炎病毒(Hepatitis A virus,HAV)流行株全基因组序列特征,收集我国6个省市不同年份同一起或不同起甲型肝炎(甲肝)暴发中,部分甲肝病例急性期血清标本,提取HAV RNA,进行VP1-2A区基因分型,RT-PCR分段扩增HAV近全基因组序列,构建系统进化树,分析基因组特征。本研究获得16条HAV近全基因组序列,均属于基因IA亚型,核苷酸和氨基酸序列同源性分别为95.81%~100%和99.23%~100%。与GenBank中HAV序列比较,15条序列与Man12-001(蒙古国株)最接近,核苷酸和氨基酸序列同源性分别为97.87%~99.81%和99.55%~99.95%;1条序列与HAJEF-K12(日本株)最接近,核苷酸和氨基酸序列同源性分别为99.37%和99.91%。本文中VP1-2A区序列完全相同的HAV流行株,来源于同一起甲肝暴发时,HAV近全基因组核苷酸序列差异为0%~0.03%;来源于不同起暴发时,核苷酸序列差异为0.18%~0.99%。16条HAV序列在已发表的中和抗原表位未发现变异,编码区氨基酸序列处于负向选择压力,16条序列间及与参考序列间未发现基因重组。本研究表明我国存在多株HAV流行株,主要为基因IA亚型;VP1-2A区序列完全相同的HAV流行株,来源于同一起甲肝暴发的HAV全基因组核苷酸序列同源性高于不同起暴发的HAV序列同源性。HAV基因分型及全基因序列分析与现场流行病学调查结果相结合,更有利于HAV溯源分析。
目的分析贵州省部分地区人源和猪源戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)流行株基因特征。方法2019-2021年在贵州省医疗机构收集急性HEV感染者(抗-HEV IgM阳性)血清标本,在屠宰场收集猪胆汁和血清标本,提取HEV核酸,对HEV ORF2区基因进行扩增和测序,构建系统进化树,分析基因型、基因亚型及其核苷酸和氨基酸同源性。结果从450例急性HEV感染者标本和196份猪标本中共获得53条人源和2条猪源HEV序列。人源序列的核苷酸和氨基酸同源性分别为81.39%-100%和95.92%-100%,猪源序列分别为87.40%和100%;人源和猪源HEV均与HEV基因4型参考株的核苷酸同源性最高,分别为89.93%和89.83%。55条HEV序列位于系统进化树的3个分支,其中24条与4b亚型、20条与4a亚型、11条与4d亚型参考株处于同一分支,且核苷酸同源性最高,分别为95.54%、93.10%、95.72%。2条人源序列各发生1个位点的氨基酸替换。结论2019-2021年贵州省部分地区人群和猪群中HEV优势流行株为基因4型,包括4b、4a和4d亚型,氨基酸序列相对保守;可能存在跨种传播。
目的比较甲型肝炎病毒(hepatitis A virus,HAV)四种核酸检测方法。方法采用A、B、C实时荧光定量RT-PCR(RT-qPCR)及D微滴芯片数字RT-PCR(RT-dPCR)分别对HAV质粒标准品、梯度稀释的HAV疫苗进行灵敏度检测;对相关病毒核酸进行特异性检测;用A、B、C方法对40份人工污染HAV牡蛎、市售牡蛎及血清标本、HAV疫苗标本进行检测,比较检出率;比较A、D方法对低浓度HAV人工污染牡蛎的回收率。结果 A、B方法对质粒标准品均可检测至10拷贝/μL;检测梯度稀释的HAV疫苗,A、B、C方法的斜率、R^(2)值、扩增效率(-3.446~-3.297、0.991~0.998、95.07%~101.051%)均在可接受范围;40份不同来源的标本,A、B、C方法的阳性检出率分别是50%(20/40)、47.5%(19/40)、55%(22/40),差异无统计学意义(χ^(2)=0.467,P=0.792);A、D方法对梯度稀释疫苗检测灵敏度无明显差别,对低浓度HAV人工污染牡蛎检测,D方法回收率高于A方法,但差异无统计学意义(F=0.294,P=0.642)。结论 A、B、C方法无明显差异,较方便快捷;在检测低浓度HAV污染的食品时,D方法略有优势,但检测成本稍高,选取检测方法可根据实际情况选择。
