金戈
- 作品数：18 被引量：19H指数：3
- 供职机构：重庆医科大学更多>>
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- 相关领域：医药卫生生物学农业科学更多>>
- 博尔纳病病毒p24和p40基因星形胶质细胞特异表达重组质粒的构建
- 2012年
- 目的构建星形胶质细胞特异性表达的博尔纳病病毒磷蛋白和核蛋白基因重组质粒,以供后续实验研究使用。方法用PCR方法扩增BDV p24和p40基因完整序列同时加入Nhe I和EcoR I酶切位点,将所得目的片段克隆至pMD18-T载体,再通过酶切连接将其连接至pCMvie-GFAP质粒中的GFAP启动子的下游,分别得到p24和p40重组质粒。用酶切、PCR以及测序3种方法鉴定重组质粒,并将质粒转染人胶质瘤细胞株(U251),采用免疫细胞化学方法检测目的蛋白表达。结果 pCMvie-GFAP-BDVp24和pCMvie-GFAP-BDVp40重组质粒经酶切、PCR鉴定可见目的条带位置与预期相符,经测序可见插入序列正确,质粒转染U251细胞后,经免疫细胞化学检测到目的蛋白表达。结论成功构建了pCMvie-GFAP-BDVp24和pCMvie-GFAP-BDVp40星形胶质细胞特异性表达质粒,为研究这两种病毒蛋白的致病机制及其对星形胶质细胞的影响提供了工具。
- 李文娟张亮邓婧金戈黄荣忠房亮谢鹏
- 关键词：博尔纳病病毒核蛋白磷蛋白星形胶质细胞
- 人内源性博尔纳样核蛋白-1的原核表达及纯化
- 2014年
- 目的原核表达人内源性博尔纳样核蛋白-1(endogenous Borna-like N element-1,EBLN-1),并进行纯化及鉴定。方法以人工合成的EBLN-1基因为模板,PCR扩增EBLN-1基因,克隆至载体pET-41a中,构建重组表达质粒pET-41aEBLN-1,转化大肠埃希菌BL21(DE3)和Rosetta中,分别于18℃和37℃下进行IPTG诱导表达。采用包涵体稀释复性法对表达蛋白进行复性,经His亲和层析纯化后,SDS-GAGE和Western blot法鉴定纯化产物。结果重组表达质粒pET-41a-EBLN-1经菌落PCR及测序鉴定构建正确。重组表达蛋白相对分子质量约48 000,以包涵体形式表达。在大肠埃希菌Rosetta中37℃诱导时表达量最高,占菌体总蛋白的30%以上,纯化后蛋白纯度可达90%,可与HRP标记的His探针特异性结合。结论成功表达并纯化了重组EBLN-1蛋白,为后续深入研究EBLN-1在人体中的生理作用及其与精神疾病的相关性奠定了基础。
- 吴迪金戈刘钊张亮黄荣忠杨德雨谢鹏
- 关键词：原核细胞基因表达纯化
- 新疆伊犁地区动物脑组织博尔纳病病毒p24基因片段的检测被引量：2
- 2010年
- 目的了解新疆伊犁地区动物脑博尔纳病病毒（Borna disease virus，BDV）感染现状，分析该病毒的种系来源，预防我国BDV大规模暴发流行。方法采用巢式逆转录实时荧光定量聚合酶链反应（FQ—RT-PCR）的方法，对新疆地区200匹马、75头驴和100只牧羊犬脑组织标本进行BDVp24基因片段的检测。并对阳性标本进行BDV p40基因片段扩增电泳，同时排除GFP—p24和pMD-19质粒污染，最后克隆测序，进行基因同源性和氨基酸序列分析并分析BDV种系发生。结果3例伊犁马、4例伊犁驴和9例牧羊犬的脑组织标本BDV p24检测阳性，阳性率分别为1．5％、5．3％、9．0％；BDV p40基因片段检测和质粒标准品GFP—p24、pMD-19检测均为阴性；BDV pPA扩增产物序列与He／80株的同源性为100％。结论新疆伊犁地区马、驴和狗可能存在BDV脑内的自然感染，该地区BDV流行株与He／80株存在同源性。
- 何丰冯裕星孙后超胡子成徐红波徐鸣明展群岭胡永波金戈张英英李雷雷谢鹏
- 关键词：博尔纳病病毒脑组织
- 博尔纳病病毒实时荧光定量PCR诊断试剂盒的评价与应用被引量：1
- 2009年
- 目的评价博尔纳病病毒(Borna disease virus,BDV)实时荧光定量PCR(FQ RT-PCR)试剂盒的各项指标,并了解其实际应用效果。方法使用BDVOL持续感染细胞株、非BDV病毒序列转染的OL细胞、正常的OL细胞,对BDV RT-PCR试剂盒的敏感性、特异性、重复性和稳定性进行评估,同时检测部分临床病人和动物外周血液RNA。结果试剂盒可以检测出的病毒RNA最低浓度为102,相当于1.5个病毒拷贝数。特异性好,无非特异检出。不同批次的试剂盒的检测结果变异系数接近1。加速破坏的试剂盒和正常试剂盒检测结果之间变异系数在2以内。对临床病人检测阳性率为3.6%,对动物检测阳性率为4.4%。结论试剂盒敏感性、特异性、重复性和稳定性均佳,是BDV基础研究、流行病学调查、临床检测的良好工具。
- 徐鸣明展群岭张英英何丰冯裕星张亮金戈李雷雷谢鹏
- 关键词：博尔纳病病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒
- 博尔纳病病毒荧光定量PCR试剂盒扩增缓冲液的优化
- 2011年
- 目的选择并优化博尔纳病病毒荧光定量PCR TaqMan探针法反应体系中的扩增缓冲液,使PCR反应体系对该病毒p24模板基因的扩增效率得到明显提高。方法通过常规PCR比较选择3种常用酸(盐酸、磷酸和硫酸)所滴定的缓冲液体系,在其基础上选择适合浓度的硫酸铵配制TSS buffer,在TSS buffer中分别加入四甲基氯化铵、TritonX-100、二甲亚砜和甜菜碱这4种常用的PCR添加剂,并确定各自的最佳工作浓度,选择扩增效果较好的添加剂与其他添加剂进行依次组合,寻找最佳的添加剂组合,最后用荧光定量PCR进行对比验证。结果在滴定酸上选择了效果最好的硫酸,配制TSS buffer硫酸铵的最佳终浓度为6 mmol/L。在添加剂的优化组合上,1.5 mol/L甜菜碱、0.15%Triton X-100、8 mmol/L四甲基氯化铵和TSS buffer组合成的TBTT buffer效果最佳,在其与TaKaRa PCR buffer的对比中,TBTT buffer效果明显好于后者。结论 成功研制优化出适合扩增博尔纳病病毒p24模板基因的扩增缓冲液。
- 金戈徐晓艳张亮马丽华黄荣忠邓婧李文娟房亮谢鹏
- 关键词：博尔纳病病毒
- 抗博尔纳病病毒核蛋白的单克隆抗体及其制备方法和应用
- 本发明涉及一株保藏编号为：CCTCC No.C201116的分泌抗博尔纳病病毒核蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株、一种由杂交瘤细胞株分泌的抗博尔纳病病毒核蛋白的单克隆抗体，所述的单克隆抗体所对应的发生特异性结合的抗原是博尔纳...
- 谢鹏徐晓艳金戈张亮
- 文献传递
- 博尔纳病病毒磷蛋白的原核表达和p24片段荧光定量PCR试剂盒的研制开发
- 背景及目的:
博尔纳病病毒(BDV)是一种嗜神经性的单股负链RNA病毒,BDV的感染宿主包括了大部分温血动物,而根据一些研究认为BDV感染也可能于人类精神疾病有关,在我国和其他国家一些地区动物、精神疾病患者和脑炎患...
- 金戈
- 关键词：博尔纳病病毒磷蛋白原核表达片段荧光定量
- 颈部动脉迂曲与缺血性脑血管病的相关临床研究
- 背景：颈动脉和椎动脉颅外段的粥样硬化性狭窄或动脉夹层是缺血性脑血管病(ICVD)重要的独立危险因素，常可导致同侧大脑半球和幕下小脑、脑干等部位发生短暂性脑缺血发作(TIA)和急性缺血性卒中(AIS)。颈部大动脉闭塞在侧支...
- 金戈
- 关键词：缺血性脑血管病
- 文献传递
- 博尔纳病病毒p24片段实时荧光定量PCR检测试剂盒
- 本发明提供了一种使用简单方便，灵敏度和特异性高的荧光定量PCR试剂盒，能够优化提高PCR的扩增效率，降低PCR污染发生率，准确、快速检测标本中的BDV核酸。本发明提供的博尔纳病病毒p24片段实时荧光定量PCR检测试剂盒包...
- 谢鹏金戈张亮徐晓艳
- 博尔纳病病毒磷蛋白的原核表达及纯化
- 2011年
- 目的构建博尔纳病病毒(Borna disease virus,BDV)磷蛋白(p24蛋白)基因重组表达质粒,原核表达p24蛋白,并进行纯化。方法通过RT-PCR法从BDV感染的少突胶质细胞株(Oligodendrocyte,OL)中扩增p24基因片段,构建重组表达质粒pET-41a-p24,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,并对表达的重组蛋白进行亲和层析纯化。结果经双酶切鉴定和测序证实,重组表达质粒pET-41a-p24构建正确;表达的重组p24蛋白相对分子质量约24 000,表达量占菌体总蛋白的30%以上,主要以可溶形式表达;纯化的重组蛋白纯度达85%左右,可与鼠抗BDV p24单克隆抗体特异性结合。结论已成功原核表达并纯化了重组BDV p24蛋白,为进一步建立BDV相关免疫学检测方法奠定了基础。
- 金戈张亮徐晓艳黄荣忠马丽华邓婧李文娟房亮谢鹏
- 关键词：博尔纳病病毒磷蛋白类原核细胞纯化
