程继忠
- 作品数：24 被引量：90H指数：6
- 供职机构：华中科技大学同济医学院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金卫生部科技专项基金湖北省自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 血吸虫多基因非融合性膜锚定表达疫苗的研究被引量：2
- 2008年
- 目的构建日本血吸虫多基因非融合性膜锚定表达疫苗pIRES-Sj97-Sj14-Sj26,并研究其免疫原性及免疫保护作用。方法构建日本血吸虫脂肪酸结合蛋白(Sj14)、谷胱甘肽-S-转移酶(Sj26)和副肌球蛋白(Sj97)的跨膜共表达质粒pIRES-Sj97-Sj14-Sj26,转染HeLa细胞。通过RT-PCR法检测Sj14、Sj26和Sj97mRNA的表达,免疫荧光(IFA)检测Sj14、Sj26和Sj97蛋白的表达。用纯化的该质粒免疫BALB/c小鼠(100μg/只),设生理盐水和空载体对照组,20只/组,每隔2周加强免疫1次,共免疫3次。末次免疫2周后,每组取10只小鼠,眼球取血并断颈处死,取脾淋巴细胞及腹腔巨噬细胞。分别检测免疫小鼠血清中总IgG抗体及脾淋巴细胞培养上清干扰素-γ(IFN-γ)水平,淋巴细胞刺激指数(SI)及NO释放量,并分析脾淋巴细胞亚群。各组中余下小鼠每只经腹部感染40±1条尾蚴,45d后剖杀,计数成虫数及肝卵数,计算减虫率和减卵率。结果构建的质粒可在体外表达。疫苗组、生理盐水组和空白质粒组血清总IgG抗体含量分别为(5.62±0.64)、(1.22±0.20)及(1.48±0.36)mg/ml,疫苗组与各对照组差异均具有统计学意义(P<0.01,P<0.05)。疫苗组、生理盐水组和空白质粒组小鼠腹腔巨噬细胞NO含量分别为(321.19±18.03)、(184.12±11.05)及(213.51±15.93)nmol/ml,疫苗组与生理盐水组间差异有统计学意义(P<0.05)。疫苗组、生理盐水组、空白质粒组小鼠脾淋巴细胞刺激指数分别为(2.25±0.29)、(1.18±0.07)及(1.22±0.09),疫苗组显著升高(P<0.01)。疫苗组INF-γ水平与各对照组相比,差异具有统计学意义(P<0.01);CD4+和CD8+T细胞百分比明显升高。疫苗组减虫率和肝减卵率分别为39.9%和43.94%。结论pIRES-Sj97-Sj14-Sj26疫苗具有较强的免疫原性,可对日本血吸虫感染的小鼠产生一定保护作用。
- 唐成武刘朔婕马彦彬梁靓郭萍王淑玉邹镇高红段秋红程继忠戴五星
- 关键词：日本血吸虫免疫保护作用
- 百日咳杆菌毒素S_1亚单位与谷胱甘肽S-转移酶融合基因在大肠杆菌中表达及其一步纯化被引量：2
- 1999年
- 研究了百日咳杆菌毒素Ｓ１亚单位与谷胱甘肽Ｓ－转移酶融合蛋白（ＧＳＴ－Ｓ１）在大肠杆菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中的表达，并一步纯化了重组ＧＳＴ－Ｓ１。首先用聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增出长度为５６０ｂｐ的编码百日咳毒素Ｓ１亚单位的ＤＮＡ片段。该片段比原编码Ｓ１蛋白的ＤＮＡ片段在其３′端缺失了１３８个碱基，将其按正确的阅读框克隆入质粒ｐＧＥＸ中ＧＳＴ基因的３′端，构成ＧＳＴ－Ｓ１融合基因表达载体ｐＧＥＸ－Ｓ１。经异丙基硫代－β－Ｄ－半乳糖苷（ＩＰＴＧ）诱导表达和十二烷基磺酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ），可见所表达的ＧＳＴ－Ｓ１融合蛋白存在于细菌上清，为可溶性蛋白。分子量为４９ｋｕ处有明显的蛋白表达带。用谷胱甘肽（ＧＳＨ）亲和层析系统，一步纯化出ＧＳＴ－Ｓ１融合蛋白。最后经凝血酶的消化，得到２３ｋｕ的重组百日咳杆菌毒素Ｓ１亚单位蛋白。
- 郑波程继忠皇甫永穆海涛海涛戴五星
- 关键词：疫苗
- 日本血吸虫26kD抗原基因在BCG中的表达被引量：9
- 1998年
- 研究了外源基因日本血吸虫２６ｋＤ抗原（Ｓｊ２６ＧＳＴ）在卡介苗（ｂａｃｉｌｕｓＣａｌｍｅｔｅ－Ｇｕｅｒｉｎ，ＢＣＧ）、耻垢分枝杆菌（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）和大肠杆菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中的表达．运用重组ＤＮＡ和聚合酶链反应（ＰＣＲ）等分子生物学技术，以表达Ｓｊ２６ＧＳＴ的Ｅ．ｃｏｌｉｐＧＥＸ衍生质粒为模板，经ＰＣＲ得到编码Ｓｊ２６ＧＳＴ的全长ｃＤＮＡ片段．将其按正确的阅读框顺序，克隆到人结核杆菌热休克蛋白（ｈｅａｔｓｈｏｃｋｐｒｏｔｅｉｎ，ＨＳＰ）７０的启动子下游，再将ＨＳＰ７０启动子和Ｓｊ２６ＧＳＴ基因一起亚克隆到Ｅ．ｃｏｌｉ－分枝杆菌穿梭质粒ｐＢＣＧ－２０００中，得到Ｅ．ｃｏｌｉ－分枝杆菌穿梭表达质粒ｐＢＣＧ－Ｓｊ２６．ｐＢＣＧ－Ｓｊ２６电转化入ＢＣＧ和Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓｍｃ２１５５中表达Ｓｊ２６ＧＳＴ抗原，所表达的天然重组Ｓｊ２６ＧＳＴ（ｒＳｊ２６ＧＳＴ）为可溶性蛋白，在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上分子量为２６ｋＤ处可见明显的表达蛋白带．其表达量分别占ＢＣＧ和Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ菌体总蛋白的１５％和１０％．可见，Ｓｊ２６ＧＳＴ基因能在ＢＣＧ中高效表达．
- 程继忠皇甫永穆海涛梁驹卿
- 关键词：BCG日本血吸虫基因表达
- 结核杆菌HSP70在耻垢分枝杆菌中的表达及其免疫原性研究被引量：22
- 1998年
- 目的在重组分枝杆菌中表达编码人结核杆菌（ＴＢ）热休克蛋白７０（ＨＳＰ７０）的ＤｎａＫ基因，并观察其对小鼠的免疫效应。方法采用基因工程和免疫学技术将ＤｎａＫ基因及其两侧的表达调控区一起从质粒ｐＭＴ－７０中切出，经末端修饰后装入大肠杆菌－分枝杆菌穿梭质粒ｐＢＣＧ－２０００中，构建成新的重组质粒ｐＢＣＧ－ＴＢ７０，并用以转化耻垢分枝杆菌及大肠杆菌，用Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测表达的ＨＳＰ７０；以重组耻垢分枝杆菌分别经皮下及腹腔免疫小鼠，用淋巴细胞刺激指数（ＳＩ）反映细胞增殖能力，以ＮＯ法检测巨噬细胞吞噬活性，并检测血清中特异性抗ＴＢＨＳＰ７０的抗体。结果ＴＢＨＳＰ７０能在分枝杆菌中表达，表达量占菌体总蛋白量的１０％，不能在大肠杆菌中表达；重组耻垢分枝杆菌以１０６ＣＦＵ的剂量经皮下免疫小鼠后，可使小鼠脾淋巴细胞刺激指数（ＳＩ）和腹腔巨噬细胞吞噬活性增高（Ｐ＜０．０５），并能刺激机体产生特异性抗ＴＢＨＳＰ７０的抗体，腹腔免疫激发的抗体滴度较皮下免疫为低，而ＳＩ无明显改变。结论构建的表达质粒ｐＢＣＧ－ＴＢ７０能在耻垢分枝杆菌中表达ＨＳＰ７０，该重组菌具有较强的免疫原性。
- 程继忠郑波肖红梁驹卿皇甫永穆
- 关键词：结核分枝杆菌基因转移免疫原性
- 硒多糖、亚硒酸钠对大鼠血硒浓度和肝细胞色素P_(450)单加氧酶系的影响被引量：2
- 1998年
- 研究了一次和连续７天腹腔注射硒多糖、亚硒酸钠对大鼠血硒浓度及肝细胞色素Ｐ４５０、ｂ５、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ－细胞色素Ｃ还原酶、谷胱甘肽硫转移酶（ＧＳＴ）和谷胱甘肽过氧化物酶（ＧＳＨ－Ｐｘ）的影响；并比较了硒多糖与亚硒酸钠的作用。结果表明：一次腹腔注射Ｓｅ０．６ｍｇ／ｋｇ体重的硒多糖和亚硒酸钠后，血硒浓度迅速增加，在注射后２小时血硒浓度达到高峰，随后血硒浓度逐渐下降。亚硒酸钠在大鼠体内的吸收和排出均较硒多糖快。连续７天腹腔注射０．２ｍｇ／ｋｇ体重剂量硒多糖和亚硒酸钠后，硒多糖和亚硒酸钠组大鼠血硒浓度分别为对照组的２．６倍和２．１倍，其中硒多糖组的血硒含量显著高于亚硒酸钠组（Ｐ＜０．０５）；硒多糖和亚硒酸钠在体内、外均降低肝细胞色素Ｐ４５０、ｂ５的含量，抑制ＧＳＴ的活性，硒多糖的作用尤为显著，分别为对照组的５７％、７０％和６２％（Ｐ＜０．０５）。两种硒化合物对ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ－细胞色素Ｃ还原酶无明显影响。硒多糖和亚硒酸钠均能显著增强ＧＳＨ－Ｐｘ的活性（Ｐ＜０．０５）。
- 程继忠海涛邬惠琼宋瑞琨
- 关键词：硒多糖亚硒酸钠血硒细胞色素P450GST
- 亚砷酸钠对大鼠肝线粒体和微粒体酶的影响被引量：2
- 1996年
- 研究了亚砷酸钠在体内、体外对大鼠肝线粒体丙酮酸脱氢酶（ＰＤＨ）、琥珀酸脱氢酶（ＳＤＨ）和微粒体酶细胞色素Ｐ－４５０、ｂ５、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ－细胞色素Ｃ还原酶、谷胱甘肽硫转移酶（ＧＳＴ）的影响；并通过观测亚砷酸钠与亚硒酸钠的作用及其对肝谷胱甘肽过氧化物酶、谷胱甘肽含量和线粒体脂质过氧化的影响，探讨亚砷酸钠的作用机理。结果表明：连续７天腹腔注射２０ｍｇ／ｋｇ的亚砷酸钠，线粒体ＰＤＨ、ＳＤＨ被抑制，分别相当于对照组的５１％和５８％。而亚硒酸钠可有效拮抗砷对ＰＤＨ、ＳＤＨ的抑制作用。亚砷酸钠显著降低肝ＧＳＨ的含量，并增强线粒体膜脂质过氧化作用（Ｐ＜０．０５）。在体内试验中，亚砷酸钠对谷胱甘肽过氧化物酶和肝微粒体酶无明显影响。亚砷酸钠在体外实验中，浓度在１０－７～１０－３ｍｏｌ／Ｌ的范围内，抑制ＳＤＨ的活力，提高ＧＳＨ的含量，且呈剂量－效应关系。结果提示。
- 程继忠邬惠琼宋瑞琨皇甫永穆柴莲花王心刚
- 关键词：亚砷酸钠线粒体微粒体酶砷
- 人结核杆菌热休克蛋白70启动子对外源基因在分枝杆菌中表达的影响被引量：6
- 1997年
- 利用聚合酶链反应技术（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ，ＰＣＲ）扩增得到１５０ｂｐ的人结核杆菌热休克蛋白（Ｈｅａｔｓｈｏｃｋｐｒｏｔｅｉｎ，ＨＳＰ）７０启动子和约６５０ｂｐ的外源基因日本血吸虫谷胱甘肽硫转移酶（ＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅＳ－ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ＧＳＴ）的ｃＤＮＡ片段。并采用Ｓａｎｇｅｒ双脱氧链终止法测定了人结核杆菌ＨＳＰ７０起始密码ＡＴＧ上游１５０ｂｐ的启动子序列。在这一区域可见与大肠杆菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）－３５和－１０区同源的碱基顺序ＴＴＧＡＧ和ＡＴＣＡＴＡ，以及ＡＴＧ上游－１２～－８处的核糖体结合位点ＧＧＡＧＧ。然后将人结核杆菌ＨＳＰ７０启动子和日本血吸虫ＧＳＴ编码基因克隆到Ｅ．ｃｏｌｉ－分枝杆菌穿梭质粒ｐＢＣＧ－２０００中，构成能表达日本血吸虫ＧＳＴ基因的Ｅ．ｃｏｌｉ－分枝杆菌穿梭表达载体ｐＢＣＧ－Ｓｊ２６。电转化耻垢分枝杆菌后，用卡那霉素筛选出阳性重组子。含有ｐＢＣＧ－Ｓｊ２６的耻垢分枝杆菌在热和过氧化氢的作用下均诱导出ＧＳＴ的表达。其表达产物分子量为２６×１０３，经聚丙烯酰胺凝胶（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）后，扫描分析，表明重组ＧＳＴ（ｒＧＳＴ）占菌体总蛋白的１０％。本研究为Ｈ?
- 程继忠皇甫永穆冯作化梁驹卿肖红
- 关键词：结核分枝杆菌热休克蛋白启动子基因表达
- 日本血吸虫26ku抗原基因在分枝杆菌和大肠杆菌中的高效表达被引量：5
- 1996年
- 构建了大肠杆菌一分枝杆菌穿梭质粒pBCG-2000,并将日本血吸虫26ku抗原(Sj26GST)基因在分枝杆菌中进行了克隆和表达.以质粒pBluescript sk为骨架,分别克隆入分枝杆菌质粒复制基因、Neo基因(编码卡那霉素抗性)以及人结核杆菌热休克蛋白70(heat shock protein,hsp70)的启动子,并带有质粒pBluescript的多克隆位点,构建成分枝杆菌-大肠杆菌穿梭质粒pBCG-2000.该重组质粒在分枝杆菌、大肠杆菌两个系统中均能稳定复制,并表达卡那霉素抗性.再以大肠杆菌表达质粒pGEX衍生质粒为模板,经过聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)得到编码日本血吸虫26ku抗原的全长DNA顺序.将其按正确的阅读框顺序,精确克隆到分枝杆菌hsp70的启动子下游,最终构建成能高效表达Sj26GST的大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达载体pBCG-Sj26.所表达的天然重组Sj26GST(rSi26GST)为可溶性蛋白,在SDS-PAGE上分子量为26ku处可见明显的表达蛋白带.提示生长缓慢的人结核杆菌hsp70的启动子能被快速生长的耻垢分枝杆菌RNA聚合酶所识别.通过薄层扫描分析,其表达效率分别占大肠杆菌、分枝杆菌菌体总蛋白的25%～37%和18%.本研究为外源基因在卡介苗(Bacille Calmette-Gu(?)rin,BCG)中的表达以及把分枝杆菌和BCG发展成为多价疫苗载体奠定了基础.
- 程继忠皇甫永穆梁驹卿陈秋生
- 关键词：分枝杆菌穿梭质粒日本血吸虫基因表达
- 卡介苗基因组的克隆
- 1996年
- 以质粒pUC19为载体克隆了卡介苗(即卡介菌,BCG)DNA.Sau3Al部分酶解BCG DNA,通过琼脂糖电泳分离2～9Kb DNA片段.BamHl酶切质粒pUC19,碱性磷酸酶去磷酸化.2～9kb DNA片段与pUC19载体用T4连接酶连接转化大肠杆菌HB101,在含氨苄青霉素(Amp)、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷的LB平板上获得抗Amp白色转化子.随机挑选12个转化子快速提取重组子、电泳检查结果:其中8个分子量扩大.选择5个分子量扩大重组子经BamHl酶切,电泳分析表明DNA插入片段约在2～7kb之间.
- 梁驹卿皇甫永穆周火明张大军程继忠
- 关键词：卡介苗基因组质粒克隆结核菌苗
- 质粒转化大肠杆菌方法的改进及受体菌转化效率的观察被引量：1
- 1995年
- 质粒转化大肠杆菌方法的改进及受体菌转化效率的观察同济医科大学实验医学研究中心医学分子生物学研究室，武汉４３００３０张慧，程继忠，李东，张桂梅，冯作化关键词质粒；转化，细菌；大肠杆菌中图法分类号Ｑ７５，Ｒ３７，Ｒ３７８．２＋１质粒转化大肠杆菌是分子生物...
- 张慧程继忠李东张桂梅冯作化
- 关键词：质粒细菌大肠杆菌
