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托佩克猪SLA-1-632-TPK基因的矫正及重组质粒SLA-1-TPK/pMD19-T的构建: 2017年; 猪白细胞抗原(swine leukocyte antigen,SLA)在猪免疫系统中起递呈抗原作用,对其展开研究可为猪相关传染病的预防提供依据。研究发现,托佩克猪SLA-1-632-TPK基因编码序列发生碱基缺失(距离SLA-1-632-TPK基因5′端632bp处丢失1个碱基"C"),导致移码突变。为矫正SLA-1-632-TPK基因,设计2对矫正引物,以原重组质粒SLA-1-632-TPK/pMD18-T为模板,利用剪切重叠延伸PCR(splicing overlap extention PCR,SOEPCR)技术分别扩增SLA-1-632-TPK 5′和3′端,之后进行拼接,最后扩增全序列从而矫正目的基因,并进一步连接pMD19-T Simple载体,通过单菌落PCR筛选阳性克隆并测序,并通过GENETYX version 9.0软件对所测序列进行分析。结果显示,SOE-PCR成功扩增得到5′和3′端片段,大小约为650和590bp,与理论设计值大小(648和585bp)接近,经过拼接以后,得到全长约1 200bp,与理论设计值1 223bp接近。菌落PCR结果显示,矫正基因成功克隆入pMD19-T Simple载体。序列分析结果显示,托佩克猪SLA-1-632-TPK基因距离5′端632bp处丢失的碱基"C"得到矫正并正确编码。本研究成功矫正了SLA-1-632-TPK基因,并构建其重组质粒SLA-1-TPK/pMD19-T,为下一步研究SLA-1-TPK蛋白表达和相关功能奠定基础。; 翟晓鑫高花韩勇高凤山

大肠杆菌表达SLA-3蛋白与口蹄疫病毒多肽的复性研究被引量：4: 2017年; 【目的】研究大约克猪SLA-3(SLA-3-YDY)蛋白在体外与口蹄疫病毒多肽的复性。【方法】设计SLA-3-YDY胞外区引物,PCR扩增目的基因,并将此片段克隆至p MD19-T Simple Vector上,双酶切筛选出阳性克隆并测序,测序正确的片段连接至表达载体p ET-21a(+)上,转化大肠杆菌感受态BL21细胞中,IPTG诱导,SDS-PAGE检测目的蛋白的表达。超声破碎菌体,提取包涵体蛋白,通过稀释复性法将重链SLA-3-YDY、轻链sβ2m和口蹄疫病毒多肽Hu52按摩尔比1:1:1加入复性液,经分子筛层析纯化并检测复合物是否复性。【结果】PCR扩增获得SLA-3-YDY目的基因,经测序阳性克隆序列与原序列一致。经酶切鉴定,证明目的基因与p ET-21a(+)载体成功连接,经IPTG诱导表达、SDS-PAGE检测,显示目的基因表达,大小约33 k D,SDS-PAGE检测包涵体蛋白,证明包涵体蛋白大小与菌体蛋白大小一致。分子筛及SDS-PAGE检测发现,通过稀释复性法实现了重链、轻链和多肽的复性,并得到蛋白复合物SLA-3-Hu52-sβ2m(45 k D)。【结论】构建了大约克猪SLA-3原核表达载体,获得目的蛋白,实现了口蹄疫病毒多肽Hu52与SLA-3重链及轻链的复性,为今后进一步研究SLA-3的结构和功能奠定基础。; 杨杰韩勇高花许崇波刘军高凤山; 关键词：大约克猪原核表达载体

新型多肽表位技术研究进展被引量：1: 2017年; 多肽表位作为抗原的重要组成成分,可以被宿主免疫系统B细胞产生的抗体(Ig)和T细胞受体(TCR)识别,从而诱导机体产生免疫保护作用。传统的研究方法如交叠肽合成等费时费力,极大地限制了多肽表位的研究。随着生物信息学、高通量测序、CRISPR/Cas9、质谱(MS)等技术出现以及TAP非依赖型蛋白加工机制的不断阐述,使表位的研究得到不断完善。作者介绍了最新的多肽表位研究方法,包括利用计算机对B细胞和T细胞表位的预测、基于MHC与抗原肽结构作用为基础的方法、结合高通量测序技术的表位筛选方法、结合新型基因编辑技术的表位筛选方法、TAP非依赖性T细胞表位的最新研究等,并对今后多肽表位研究的发展进行了展望。; 韩勇高花翟晓鑫高凤山; 关键词：多肽表位

MHC分子抗原递呈机制的研究进展被引量：14: 2017年; MHC分子限制性抗原递呈机制在细胞免疫应答中占有绝对重要地位,对MHC抗原递呈机制的研究一直是免疫学研究的热点。尽管抗原分子经过MHC分子递呈和加工机制已经被研究了近40年,且抗原递呈机制的基本途径已经在10年前基本阐明,但近几年仍发现MHC一些新的递呈机制和特点。MHC分子抗原递呈过程十分繁琐,涉及许多蛋白质、分子伴侣等之间的相互作用。现综述了MHC分子所递呈限制性抗原的产生、运输以及抗原交叉递呈等方面的最新研究进展。; 高花韩勇翟晓鑫高凤山; 关键词：MHC 抗原递呈交叉递呈免疫应答

新型基因组编辑技术研究进展被引量：3: 2015年; 基因组编辑技术是一种能精确靶向修饰生物基因组,实现对基因定点敲除和外源基因定点整合的技术。新出现的锌指核酸酶(ZFN)、转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)和规律性重复短回文序列簇与Cas9蛋白(CRISPRs/Cas9)系统3种新型的基因组编辑技术通过特异性结构识别靶位点,核酸酶发挥切割作用对靶位点进行定点编辑。3种新型基因编辑技术因具有高效准确、制作简单、耗时短等特点而在生命科学研究中得到广泛应用。论文对目前三种新型的基因组定点编辑技术的特点、结构原理、构建方法以及在传统生物模型、功能基因筛选、人类遗传病基因治疗等方面中的应用做一综述。; 韩勇杨杰李子彬董宋鹏高凤山; 关键词：锌指核酸酶

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韩勇