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阳性细胞中MHCⅠ类分子对抗原多肽表位的筛选: 目的大多数细胞系中存在多种MHC I类蛋白,但MHC I类分子纯化是复杂的。针对特定I分子可用特异性抗体纯化,但等位基因特异性抗体可能偏向抗原结合槽中已结合配体。通过对SLA I类分子C-末端添加标签,使SLA I类分子...; 高花翟晓鑫张宗辉高凤山; 文献传递

托佩克猪SLA-1-632-TPK基因的矫正及重组质粒SLA-1-TPK/pMD19-T的构建: 2017年; 猪白细胞抗原(swine leukocyte antigen,SLA)在猪免疫系统中起递呈抗原作用,对其展开研究可为猪相关传染病的预防提供依据。研究发现,托佩克猪SLA-1-632-TPK基因编码序列发生碱基缺失(距离SLA-1-632-TPK基因5′端632bp处丢失1个碱基"C"),导致移码突变。为矫正SLA-1-632-TPK基因,设计2对矫正引物,以原重组质粒SLA-1-632-TPK/pMD18-T为模板,利用剪切重叠延伸PCR(splicing overlap extention PCR,SOEPCR)技术分别扩增SLA-1-632-TPK 5′和3′端,之后进行拼接,最后扩增全序列从而矫正目的基因,并进一步连接pMD19-T Simple载体,通过单菌落PCR筛选阳性克隆并测序,并通过GENETYX version 9.0软件对所测序列进行分析。结果显示,SOE-PCR成功扩增得到5′和3′端片段,大小约为650和590bp,与理论设计值大小(648和585bp)接近,经过拼接以后,得到全长约1 200bp,与理论设计值1 223bp接近。菌落PCR结果显示,矫正基因成功克隆入pMD19-T Simple载体。序列分析结果显示,托佩克猪SLA-1-632-TPK基因距离5′端632bp处丢失的碱基"C"得到矫正并正确编码。本研究成功矫正了SLA-1-632-TPK基因,并构建其重组质粒SLA-1-TPK/pMD19-T,为下一步研究SLA-1-TPK蛋白表达和相关功能奠定基础。; 翟晓鑫高花韩勇高凤山

新型多肽表位技术研究进展被引量：1: 2017年; 多肽表位作为抗原的重要组成成分,可以被宿主免疫系统B细胞产生的抗体(Ig)和T细胞受体(TCR)识别,从而诱导机体产生免疫保护作用。传统的研究方法如交叠肽合成等费时费力,极大地限制了多肽表位的研究。随着生物信息学、高通量测序、CRISPR/Cas9、质谱(MS)等技术出现以及TAP非依赖型蛋白加工机制的不断阐述,使表位的研究得到不断完善。作者介绍了最新的多肽表位研究方法,包括利用计算机对B细胞和T细胞表位的预测、基于MHC与抗原肽结构作用为基础的方法、结合高通量测序技术的表位筛选方法、结合新型基因编辑技术的表位筛选方法、TAP非依赖性T细胞表位的最新研究等,并对今后多肽表位研究的发展进行了展望。; 韩勇高花翟晓鑫高凤山; 关键词：多肽表位

MHCⅠ类分子交叉递呈外源性抗原多肽研究进展: 主要组织相容性复合体(MHC)是机体内负责将抗原多肽递呈到细胞表面进而激活T淋巴细胞的重要物质。经典的抗原递呈理论认为,外源性抗原被吞噬之后进入到内吞小室中,此时MHCⅡ类分子进入内吞小室中并与外源性抗原结合之后将该类抗...; 翟晓鑫高花张宗辉高凤山

荷包猪SLA-1重链四聚体前体链的构建及表达研究被引量：1: 2017年; 试验旨在构建荷包猪猪白细胞抗原1(swine lymphocyte antigen 1,SLA-1)重链四聚体前体链并研究其在表达载体pET-21a(+)中蛋白的表达情况。以SLA-1全基因序列为模板,结合表达载体的特点设计引物,利用PCR扩增技术在SLA-1-HB01胞外区序列C-末端加载上可生物素酰化序列(BirA substrate peptide,BSP)。将PCR扩增产物SLA-1-HB01-BSP克隆到pEASY T1载体上,筛选出阳性克隆菌SLA-1-HB01-BSP/pEASY T1,经双酶切后进一步与表达载体pET-21a(+)连接,再转化到E.coli BL21感受态细胞中构建pET-21a(+)/SLA-1-HB01-BSP重组表达菌,通过IPTG诱导蛋白表达,SDS-PAGE检测蛋白的大小及表达情况,提取包涵体检测蛋白的纯度。PCR扩增结果显示,SLA-1-HB01-BSP大小为898bp,与理论值相符,扩增片段成功克隆至pEASY T1载体构建克隆菌,经NdeⅠ和XhoⅠ双酶切筛选及测序,成功获得阳性克隆菌株SLA-1-HB01-BSP/pEASY T1,插入的目的基因片段大小为876bp。阳性克隆菌株与pET-21a(+)表达载体经NdeⅠ和XhoⅠ双酶切后进行连接,转化E coli BL21感受态细胞后获得pET-21a(+)/SLA-1-HB01-BSP重组表达菌,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测目的蛋白大小为31.4ku。进一步检测分析发现,目的蛋白以包涵体形式存在,且蛋白纯度达到80%以上。本研究成功构建了荷包猪SLA-1-HB01重链四聚体前体链的pET-21a(+)重组表达体系,为下一步进行猪SLAⅠ类分子四聚体的检测奠定基础。; 高花郭杨翟晓鑫张宗辉高凤山; 关键词：荷包猪四聚体

大肠杆菌表达SLA-3蛋白与口蹄疫病毒多肽的复性研究被引量：4: 2017年; 【目的】研究大约克猪SLA-3(SLA-3-YDY)蛋白在体外与口蹄疫病毒多肽的复性。【方法】设计SLA-3-YDY胞外区引物,PCR扩增目的基因,并将此片段克隆至p MD19-T Simple Vector上,双酶切筛选出阳性克隆并测序,测序正确的片段连接至表达载体p ET-21a(+)上,转化大肠杆菌感受态BL21细胞中,IPTG诱导,SDS-PAGE检测目的蛋白的表达。超声破碎菌体,提取包涵体蛋白,通过稀释复性法将重链SLA-3-YDY、轻链sβ2m和口蹄疫病毒多肽Hu52按摩尔比1:1:1加入复性液,经分子筛层析纯化并检测复合物是否复性。【结果】PCR扩增获得SLA-3-YDY目的基因,经测序阳性克隆序列与原序列一致。经酶切鉴定,证明目的基因与p ET-21a(+)载体成功连接,经IPTG诱导表达、SDS-PAGE检测,显示目的基因表达,大小约33 k D,SDS-PAGE检测包涵体蛋白,证明包涵体蛋白大小与菌体蛋白大小一致。分子筛及SDS-PAGE检测发现,通过稀释复性法实现了重链、轻链和多肽的复性,并得到蛋白复合物SLA-3-Hu52-sβ2m(45 k D)。【结论】构建了大约克猪SLA-3原核表达载体,获得目的蛋白,实现了口蹄疫病毒多肽Hu52与SLA-3重链及轻链的复性,为今后进一步研究SLA-3的结构和功能奠定基础。; 杨杰韩勇高花许崇波刘军高凤山; 关键词：大约克猪原核表达载体

MHC分子抗原递呈机制的研究进展被引量：14: 2017年; MHC分子限制性抗原递呈机制在细胞免疫应答中占有绝对重要地位,对MHC抗原递呈机制的研究一直是免疫学研究的热点。尽管抗原分子经过MHC分子递呈和加工机制已经被研究了近40年,且抗原递呈机制的基本途径已经在10年前基本阐明,但近几年仍发现MHC一些新的递呈机制和特点。MHC分子抗原递呈过程十分繁琐,涉及许多蛋白质、分子伴侣等之间的相互作用。现综述了MHC分子所递呈限制性抗原的产生、运输以及抗原交叉递呈等方面的最新研究进展。; 高花韩勇翟晓鑫高凤山; 关键词：MHC 抗原递呈交叉递呈免疫应答

荷包猪SLA-2-HB01真核表达载体的构建及在PK15细胞中的表达: 2018年; 为构建荷包猪SLA-2-HB01真核细胞表达载体,观察其在PK15细胞中的表达情况。首先参考SLA-2-HB01基因编码区序列设计了引物对,以SLA-2-HB01-pMD 18-T为模板PCR扩增获得SLA-2-HB01编码区基因片段,经TA克隆及菌落PCR筛选得到阳性克隆菌。测序正确后大量双酶切回收目的基因片段并与真核表达载体pEGFP N3相连接获得重组质粒SLA-2-HB01/pEGFP N3,重组质粒转化至大肠杆菌经大量克隆后,抽提阳性重组质粒并通过脂质体介导转染至PK15细胞,通过荧光显微镜观察转染后PK15细胞的荧光强度,进一步通过Western Blotting检测PK15细胞中SLA-2-HB01蛋白的表达情况。结果显示PCR成功扩增得到SLA-2-HB01,大小为1 104 bp,并成功构建重组质粒SLA-2-HB01/pEGFP N3,酶切鉴定证实插入片段大小为1 092 bp。SLA-2-HB01/pEGFP N3重组质粒转染PK15细胞后具有绿色荧光,Western Blotting显示SLA-2-HB01-EGFP融合蛋白分子量大小为70 kD,与理论值相符。成功构建了SLA-2-HB01/pEGFP N3重组质粒,并初步确认SLA-2-HB01-EGFP融合蛋白成功在PK15细胞中表达,为下一步进行SLA-2-HB01递呈多肽表位的研究奠定基础。; 翟晓鑫高花姜平许崇波张宗辉李文哲高凤山; 关键词：荷包猪 PK15细胞 SLA-2 真核表达载体

荷包猪SLA-3-HB 01基因四聚体前体链的构建及表达: 2018年; 为了构建荷包猪SLA-3-HB01基因四聚体前体链原核表达载体,并获得SLA-3-HB01表达蛋白,试验以SLA-3-HB01/pMD18-T为模板进行PCR扩增四聚体前体链SLA-3-HB01-BSP,并克隆至pMD19-T载体中,经NdeⅠ和XhoⅠ双酶切筛选阳性克隆并测序,目的基因连接至表达载体pET-21a(+),转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测目的蛋白大小及表达情况,提取包涵体并进行检测。结果显示,PCR成功扩增得到SLA-3-HB01-BSP,大小为896bp左右。酶切鉴定证实,目的基因成功克隆至pMD19-T载体中,插入片段大小为876bp,阳性克隆经测序后所获序列与原序列一致,并在3′端带有BSP标签序列。酶切鉴定进一步证实成功构建SLA-3-HB01-BSP/pET-21a(+)重组表达载体,经转化及诱导表达,SDS-PAGE检测显示目的蛋白分子质量在33.5ku左右。包涵体蛋白分子质量约33.5ku,与菌体中目的蛋白大小一致,经凝胶成像系统UVP扫描分析,包涵体蛋白纯度接近于90%,符合进行相关结构和功能研究的要求。本研究成功构建了荷包猪SLA-3-HB01基因四聚体前体链的pET-21a(+)重组表达系统,并获得了一定纯度的包涵体蛋白。; 高花翟晓鑫姜平甘慧张宗辉许崇波高凤山; 关键词：密码子优化包涵体

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