李梦悦
- 作品数：2 被引量：2H指数：1
- 供职机构：齐鲁工业大学生物工程学院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：生物学轻工技术与工程化学工程更多>>
- 毕赤酵母表面展示海藻糖合酶技术的研究
- 海藻糖合酶是一种能够一步法转化麦芽糖生成海藻糖的酶制剂，其底物专一性较高，使用该酶生产海藻糖工艺简单，不受底物麦芽糖浓度的影响，是工业生产海藻糖的首选。 为获得具有生产海藻唐合酶能力的毕赤酵母表面展示载体，以实验室筛选...
- 李梦悦
- 关键词：海藻糖海藻糖合酶毕赤酵母酶制剂发酵试验
- 海藻糖合酶在毕赤酵母表面的展示被引量：2
- 2016年
- 海藻糖合酶能够利用麦芽糖一步法转化生产海藻糖,其底物专一性较高,该酶体系生产工艺简单,不受底物麦芽糖浓度的影响,是工业生产海藻糖的首选。为获得具有生产海藻糖合酶能力的毕赤酵母表面展示载体,实验以筛选的Pseudomonas putide P06海藻糖合酶基因为模板,PCR扩增得到海藻糖合酶基因(tres,2 064 bp),连接至pPICZαA质粒中,获得重组质粒pPICZαA-tres。以来自酿酒酵母的共价连接细胞壁的Pir系列蛋白的Pir1p成熟肽蛋白作为毕赤酵母表面展示的锚定蛋白,利用PCR技术扩增得到pir1p(847 bp),连接至重组质粒pPICZαA-tres中,获得重组质粒pPICZαA-tres-pir1p。将重组质粒电击转入毕赤酵母GS115中,利用α-factor信号肽将蛋白引导分泌至细胞壁展示于毕赤酵母表面。通过Zeocin抗性筛选,挑选出阳性克隆子并摇瓶发酵。发酵产物经离心、破碎并使用昆布多糖酶水解,洗脱,结果显示,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析可见明显融合蛋白条带,表明海藻糖合酶已成功地锚定在毕赤酵母。将重组毕赤酵母使用p H 7.5的缓冲液清洗并重悬,与底物浓度为30%的麦芽糖在30℃~60℃水浴条件下作用2 h,反应产物利用HPLC检测,能够检测到酶学活性。在优化后的条件p H 7.5,50℃,表面展示海藻糖合酶酶活达到300.65 U/g。40℃~50℃酶活较稳定,保温60 min,残留酶活相对活力达75%以上;最适反应p H值为7.5,并在碱性环境下稳定。
- 李梦悦王腾飞汪俊卿赵一瑾程成王瑞明
- 关键词：海藻糖海藻糖合酶毕赤酵母
