黄薇
- 作品数：7 被引量：4H指数：1
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- 一种高效制备人β2微球蛋白标准物质的方法和应用被引量：1
- 2018年
- 目的构建重组人β2微球蛋白表达体系,高效快速获取β2微球蛋白,为临床实验室检测参考物质的制备奠定基础。方法优化人β2微球蛋白序列,人工合成优化序列片段并与麦芽糖结合蛋白(MBP)分别克隆至pRSF-Duet载体以构建重组人β2微球蛋白表达质粒。使用大肠杆菌E.coli BL21(DE3)对重组质粒进行诱导表达,TEV蛋白酶切除MBP,全自动生化仪测定β2微球蛋白浓度。对重组蛋白在4℃和–20℃储存条件下的稳定性进行检测,对β2微球蛋白纯品与校准品的互通性进行分析。结果成功构建重组人β2微球蛋白表达质粒,异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)成功诱导重组蛋白表达,MBP-β2微球蛋白(MBP-β2-MG)浓度可达100 mg/L,β2微球蛋白浓度可达185 mg/L。在4℃和–20℃储存条件下监测64周,β2微球蛋白稳定存在。β2微球蛋白纯品与RANDOX生化校准品互通性良好。结论通过密码子优化,成功构建了重组β2微球蛋白的高效表达系统,β2微球蛋白可溶性高,稳定性好,与国际通用校准品互通性好,可充分满足该产品诊断试剂制备的需求。
- 邹丽辉王萌黄薇张恩毅肖飞王玉梅
- 关键词：Β2微球蛋白重组蛋白质类
- 一种高效制备人乳酸脱氢酶LDH_5参考物质的方法及应用
- 2017年
- [目的]研究高效、廉价制备人乳酸脱氢酶LDH5参考物质的方法。[方法]选取人乳酸脱氢酶基因(LDHA)CDS序列进行分析及优化,合成优化后的基因,克隆至表达载体pRSF-Duet中构建重组乳酸脱氢酶LDH5表达载体。使用大肠杆菌E.coli BL21(DE3)菌株对目的基因进行表达,异丙基硫代半乳糖苷酶(IPTG)诱导,镍离子亲和层析纯化,SDS-PAGE鉴定酶纯度,BCA法分析酶浓度,全自动生化仪分析酶活性、稳定性。[结果]经优化后的LDHA基因的大肠杆菌密码子适应指数为1;纯化蛋白达到电泳纯,比活性达19.01 U/mg,在4℃及25℃可稳定保存8 d。[结论]重组乳酸脱氢酶的表达效率为100 mg/L,酶活性、稳定性、纯度达到临床生化检测的参考物质的条件,可以作为血清乳酸脱氢酶检测的标准物质。
- 刘赪阳王玉梅黄薇王萌张恩毅郭健肖飞
- 关键词：乳酸脱氢酶基因重组密码子
- 应用基因密码子优化技术建立高效人降钙素原的原核表达方法及产品纯化和鉴定
- 2022年
- 目的建立人降钙素原(procalcitonin,PCT)表达体系,高效表达可溶性PCT蛋白。方法合成PCT蛋白密码子优化序列,克隆至带麦芽糖结合蛋白(maltose-binding protein,MBP)标签的pRSF-Duet载体以构建pMBP-PCT-pRSF原核表达质粒。在E.coli BL21(DE3)pLysS菌株中诱导表达,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gelelectrophoresis,SDS-PAGE)鉴定蛋白分子量及纯度,生物梅里埃VIDAS全自动荧光免疫分析仪检测蛋白浓度、稳定性及均匀性。结果pMBP-PCT-pRSF质粒成功构建及表达,浓度达168(168.00±2.65)mg/L,纯度达95%。在4℃及-20℃储存,PCT蛋白具有良好的稳定性(F=2.016,2.620,均P>0.05)和均匀性(F=0.7273,0.9739,均P>0.05)。结论利用密码子优化,成功构建可溶性PCT蛋白的高效原核表达体系,可充分满足临床实验室参考物质的需求。
- 罗玄梅黄薇孙高远汤小琨王璐瑶邹丽辉
- 关键词：降钙素原重组蛋白质类
- 人胱抑素C参考物质制备方法的建立
- 2018年
- [目的]建立重组人胱抑素C(cystatin C)表达体系,获得可溶、稳定、高纯度的胱抑素C。[方法]密码子优化并人工合成人胱抑素C编码序列,与麦芽糖结合蛋白(MBP)分别克隆至PRSF-Duet载体以构建重组人p MBP-CYSC PRSF表达质粒。使用大肠杆菌E. coli BL21(DE3) p Lys S对其进行诱导表达,SDS-PAGE鉴定蛋白纯度和分子量,全自动生化仪测定纯化蛋白浓度及稳定性。[结果]成功构建重组人p MBP-CYSC PRSF表达质粒并诱导表达,胱抑素C蛋白浓度可达500 mg/L,纯度可达90%,在4℃和-20℃储存条件下监测64 w,胱抑素C蛋浓度稳定,均在允许相对偏差5%以内。[结论]通过密码子优化,成功获得浓度为500 mg/L、纯度为90%、存储稳定性至少达到64 w的胱抑素C蛋白,可充分满足该产品诊断试剂制备的需求。
- 邹丽辉邹丽辉王萌张恩毅黄薇张恩毅肖飞
- 关键词：重组蛋白表达
- 脑钠肽的重组表达、纯化及其在临床检验质控中的应用
- 2023年
- [目的]制备脑钠肽(brain natriuretic peptide,BNP)重组蛋白,为临床实验室检测BNP提供稳定可靠、方便快捷的质控品或参考品原料。[方法]优化BNP编码密码子,与麦芽糖结合蛋白(maltose-binding protein,MBP)编码基因及FXa识别序列一并克隆至表达载体pRSFDuet-1,在大肠杆菌工程菌BL21(DE3)中诱导表达,可溶性表达产物MBP-BNP经纯化、丝氨酸蛋白酶FXa切除MBP后,获得具有生物活性的BNP蛋白。[结果]将NPPB(natriuretic peptide precursor B,NPPB)基因参考序列内26%的罕见密码子全部替换成了大肠杆菌常用密码子,成功构建了重组表达质粒MBP-BNP-pRSFDuet-1,酶切、测序鉴定正确后转入BL21(DE3)获得可溶性高表达MBP-BNP融合蛋白的工程菌株。用镍柱和交联葡聚糖G50分子筛纯化后获得250 mg/L的MBP-BNP融合蛋白,经FXa切除MBP后得到1.65 mg/L的BNP蛋白,比临床实验室常规BNP检测区间上限高出约50倍。[结论]与传统的参考品制备方法相比,运用基因工程技术可在大肠杆菌中稳定可溶性表达浓度较高的BNP蛋白,可为临床实验室提供更方便快捷、质优价廉的质控品或标准品原材料,提供了理论基础和技术保障。
- 李贺鑫汤小琨孙高远黄薇黄薇张俊华王萌张俊华
- 关键词：脑钠肽基因重组标准品质控
- 西格列汀及胰高血糖素样肽1对脐静脉内皮细胞铁代谢相关基因的调控作用被引量：3
- 2017年
- 目的 观察西格列汀及胰高血糖素样肽1（GLP-1）对正常糖浓度（正糖）及高糖条件下人脐静脉内皮细胞（HUVECs）铁代谢相关共济蛋白（FXN）及顺乌头酸梅1（ACO1）蛋白表达的影响.方法 用西格列汀（1μmol/L）和（或）GLP-1（100 nmol/L）处理HUVECs,正糖（5.5 mmol/L）及高糖（30.0 mmol/L）状态下分别设相应对照组、GLP-1处理组、西格列汀处理组以及GLP-1＋西格列汀联合处理组.检测药物对正常状态下HUVECs细胞增殖的影响,用实时定量逆转录PCR和Western blotting法分别于24 h及48 h后检测HUVECs内FXN和ACO1的mRNA及蛋白表达水平.多组间比较采用单因素方差分析,两组间比较使用Bonferroni检验（满足方差齐性检验时）或Dunnett T3检验（不满足方差齐性检验时）.结果 （1）正糖下经西格列汀和（或）GLP-1处理24 h后,与对照组（表达水平设为1）相比,各组的HUVECs细胞增殖水平均无明显变化（分别为0.99±0.04、1.07±0.08、1.06±0.05,F=4.059,均P〉0.05）;而各加药组的FXN mRNA表达均呈下降趋势,其中,西格列汀＋GLP-1组FXN的mRNA表达水平降低为0.68±0.18（t=3.59,P〈0.05）;西格列汀单独或联合GLP-1组ACO1的mRNA表达水平也明显降低（分别为0.49±0.13、0.59±0.15,F=10.802,均P〈0.05）;各加药组的FXN及ACO1的蛋白水平均低于对照组,但差异无统计学意义（均P〉0.05）.（2）高糖下经西格列汀和（或）GLP-1处理48 h后,与对照组（表达水平设为1）相比,西格列汀＋GLP-1组FXN mRNA表达升高（1.75±0.26,t=-5.71,P〈0.05）;但各组的ACO1 mRNA表达变化均不明显且差异无统计学意义（均P〉0.05）.结论 西格列汀和GLP-1可在不影响正常状态内皮细胞增殖的条件下,通过调节正常或高糖状态下HUVECs中FXN及ACO1的表达水平影响细胞内的铁代谢.
- 李莉金军华邹丽辉张恩毅张俊华黄薇潘琦肖飞
- 关键词：胰高血糖素样肽1人脐静脉内皮细胞
- 定量检测肌氨酸的肌氨酸氧化酶方法及检测试剂盒
- 本发明公开了一种定量检测肌氨酸的肌氨酸氧化酶方法及检测试剂盒，本发明在原有肌氨酸氧化酶分光光度检测法的基础上，着重改善原有方法灵敏度不足以满足临床检测的缺点。选用目前检测灵敏度较高、稳定性较好的色原物质，使用双试剂检测法...
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- 文献传递
