吴旭东
- 作品数：3 被引量：5H指数：1
- 供职机构：天津医科大学基础医学院细胞生物学系更多>>
- 发文基金：天津市高等学校科技发展基金计划项目国家自然科学基金国家重点基础研究发展计划更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 应用CRISPR/Cas9系统在G401细胞株中敲除p21基因被引量：1
- 2016年
- 目的运用CRISPR/Cas9基因编辑技术,在人恶性横纹肌样瘤细胞株G401中敲除p21基因。方法通过反转录定量PCR(RT-q PCR)及Western blot检测各瘤细胞株中p21的表达,针对p21基因作用的功能域,设计了靶向人p21基因第3个外显子的向导RNA(sg RNA),克隆入lenti CRISPR v2载体。将测序及酶切鉴定正确的重组质粒在293T工具细胞中制备慢病毒颗粒并感染G401细胞,使用嘌呤霉素进行阳性细胞筛选,显微镜下挑取单克隆细胞团并继续培养获得G401单克隆细胞株。提取单克隆细胞株RNA及蛋白,利用RT-q PCR及Western blot方法检测细胞株中p21的敲除效果。结果 p21在人横纹肌样瘤细胞中高表达。成功构建靶向p21基因的lenti CRISPRv2-sg RNA重组慢病毒质粒。与对照组相比,筛选得到的G401亚克隆细胞系中p21蛋白表达缺失。结论针对难转染的G401细胞,应用CRISPR/Cas9系统成功构建了p21基因敲除的稳定株,为后续深入研究p21在人恶性横纹肌样瘤中的作用机制奠定了基础。
- 赵秀娟陈万标张沛涛张娜楚晓文白向阳杨冰吴旭东王玺
- 关键词：横纹肌瘤P21基因敲除慢病毒
- 白藜芦醇对H2O2及TGF-β2诱导人小梁网细胞的影响及机制探讨被引量：1
- 2016年
- 目的观察过氧化氢（H2O2）及转化生长因子（TGF）-β2诱导人小梁网细胞（HTMCs）后对纤维连接蛋白（FN）、胶原蛋白1型（COL1）、核因子（NF）-κBP65蛋白和白细胞介素（IL）-1β基因表达的影响及白藜芦醇（RSV）的干预作用。方法（1）选取汇合度70%～80%的HTMCs分为5组。实验组于无血清培养基中分别加入浓度为150、300、450、800μmol/L的H2O2处理，对照组的培养基中不加H2O2。Westernblot法检测各组FN、COL1、NF-κBP65、NF-κBP65磷酸化（P-NF-κBP65）蛋白的表达，实时定量PCR法检测IL-1β基因的表达。（2）HTMCs细胞分为3组。对照组以不含H2O2及RSV的无血清培基处理，H2O2组以300μmol/L的H2O2处理，H2O2+RSV组同时加入300μmol/L的H2O2及25μmol/L的RSV处理。检测各组上述蛋白和基因的表达情况。免疫荧光检测各组NF-κBP65在HTMCs中的定位。（3）HTMCs细胞分为3组。对照组以不含TGF-β2及RSV的无血清培基处理，TGF-β2组以5μg/L的TGF-β2处理，TGF-β2+RSV组为同时加入5μg/L的TGF-β2及25μmol/L的RSV处理。检测各组上述蛋白和基因的表达情况。结果（1）与对照组比较，150、300、450、800μmol/L组FN和P-NF-κBP65蛋白表达水平均增高，300、450、800μmol/L组COL1蛋白和IL-1β基因表达水平增高（P<0.05），其他指标比较差异均无统计学意义。（2）H2O2组较对照组FN、COL1、P-NF-κBP65蛋白和IL-1β基因表达水平均增高，而H2O2+RSV组较H2O2组上述指标均降低，H2O2+RSV组较对照组仅IL-1β降低（P<0.05）。对照组仅细胞质表达NF-κBP65，H2O2组细胞胞质及核中均有NF-κBP65表达，且核中表达较多；H2O2+RSV组细胞胞质中表达NF-κBP65较核中多。（3）TGF-β2组较对照组FN、COL1、P-NF-κBP65的蛋白和IL-1β基因水平表达均增高（P<0.05），TGF-β2+RSV组较TGF-β2组上述指标均降低（P<0.05）。结论H2O2和TGF-β2能上调HTMCs的FN、COL1、P-NF-κBP65蛋白及IL-1β基因的�
- 齐艳赵秀娟徐琳琪吴旭东汪建涛
- 关键词：小梁网转化生长因子Β2白细胞介素1Β白藜芦醇
- 利用CRISPR/Cas9n系统构建Asxl2基因敲除的NIH3T3稳定细胞系被引量：3
- 2015年
- 目的利用CRISPR/Cas9n系统在NIH3T3小鼠胚胎成纤维细胞系中敲除Asxl2基因。方法设计一对靶向小鼠Asxl2基因第5个外显子的小向导RNA(sg RNA),分别克隆进p X462载体。将测序鉴定正确的重组质粒转染至NIH3T3细胞中,利用有限稀释法得到单细胞,通过培养获得单克隆细胞系。提取单克隆细胞系基因组DNA,ge-notyping PCR扩增出靶位点附近的DNA片段并测序。利用Western blot方法检测细胞株中Asxl2的敲除效果。结果成功构建靶向Asxl2的CRISPR/Cas9n重组质粒。将2个重组质粒共转染NIH3T3细胞,嘌呤霉素筛选后得到亚克隆细胞系,并且经genotyping PCR测序验证得到一株正确的单克隆细胞系。Western blot证实敲除Asxl2后,该NIH3T3细胞系中Asxl2蛋白表达缺失。结论通过这个系统得到了靶向Asxl2的CRISPR/Cas9n重组质粒及稳定敲除Asxl2的NIH3T3细胞系。
- 方佳萍赵秀娟齐艳王玺吴旭东娄建石
- 关键词：表观遗传
