董伟
- 作品数：2 被引量：3H指数：1
- 供职机构：安徽医科大学基础医学院病理生理学教研室更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 人miR-100-3p抑制序列慢病毒载体及其稳定表达的小鼠胚胎成纤维细胞的建立被引量：1
- 2017年
- 目的构建携带针对人miR-100-3p抑制序列的慢病毒载体,建立稳定表达的该载体的小鼠胚胎成纤维(MEF)细胞。方法设计并合成特定的miR-100-3p抑制序列克隆入载体h U6-MCS-Ubiquitin-EGFP-IRES-puromycin构建重组载体,将该载体与p Helper1.0载体和p Helper2.0载体三质粒共感染293T细胞得到所需的病毒液,最后感染MEF细胞,并通过嘌呤霉素筛选出稳定感染的细胞株。检测MEF细胞中绿色荧光蛋白(GFP)的表达和hsa-miR-100-3p在MEF细胞中的表达水平,验证慢病毒在MEF细胞中的抑制表达效果。结果测序结果证明成功构建了重组质粒,并成功的包装成慢病毒,所得病毒液感染MEF细胞并筛选出稳定细胞株。流式分析提示,带有绿色荧光蛋白的目的重组质粒在小鼠胚胎成纤维细胞细胞中的表达(显著抑制miR-100表达)达到了97.4%和95.1%,PCR进一步验证这一结果。结论 hsa-MiR-100-3p抑制序列慢病毒沉默载体及抑制miR-100-3p表达的MEF细胞可被成功构建,为后续miR-100的功能研究奠定基础。
- 朱其苹郭强邓瑞晴董伟任海风倪芳汪思应
- 关键词：慢病毒
- hsa-miR-100-3p抑制剂慢病毒表达载体稳定感染BEAS-2B细胞株的建立被引量：2
- 2016年
- 目的建立稳定感染人hsa-miR-100-3p抑制剂慢病毒表达载体的人支气管上皮(human bronchial epithelial,BEAS-2B)细胞株,为研究miR-100的功能奠定基础。方法根据hsa-miR-100-3p的成熟序列,设计其反向互补序列,用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)的方法扩增目的基因,将目的基因与慢病毒载体GV280经双酶切后,进行定向连接,产生GV280-hsa-miR-100-3p-inhibitor慢病毒表达载体。将制备好的重组慢病毒质粒与两种辅助包装原件载体质粒共转染人胚肾上皮细胞293(human embryo kidney epithelial cell,HEK-293)T细胞,包装产生病毒颗粒并以最适滴度感染BEAS-2B细胞以获得稳定感染的细胞株。倒置荧光显微镜观察感染效率,用逆转录聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)的方法检测重组慢病毒感染后BEAS-2B细胞中miR-100的相对表达量。结果测序结果表明,目的基因成功的连接到慢病毒载体上,重组慢病毒高效的感染了BEAS-2B细胞。RT-PCR检测发现,BEAS-2B细胞中miR-100的相对表达明显的下调了。结论稳定感染hsa-miR-100-3p抑制剂的BEAS-2B细胞株构建成功,敲低了细胞中内源性miR-100的表达。
- 董伟刘媛媛陈志军姜玉朱其苹汪思应
- 关键词：聚合酶链式反应慢病毒属微RNAS
