刘海楠
- 作品数：10 被引量：11H指数：2
- 供职机构：石河子大学农学院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：农业科学生物学更多>>
- ‘小白杏’自交不亲和SFB基因RNAi表达载体的构建被引量：2
- 2016年
- 【目的】应用RNA干扰(RNAi)技术在分子水平调控杏自交不亲和性状,为培育自交亲和杏品种奠定基础。【方法】基于南疆自交不亲和杏品种‘小白杏’(Prunus armeniaca‘Xiaobaixing’)花粉决定子SFB(S-haplotype-specific Fbox protein)基因3’端c DNA全长序列,选取SFB基因变异区上游距起始密码子61 bp处、大小为29 bp的片段作为干扰序列,棉花基因组DNA 242 bp的序列作为间隔片段,利用融合PCR(Fusion PCR)构建SFB基因发卡结构(intron-containing hairpin RNA,ihp RNA),再酶切连接到植物表达载体p CAMBIA-35S-MCS-NOS-NPTII上,构建SFB基因RNAi表达载体;用冻融转化法将重组质粒转化至农杆菌菌株(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404中。【结果】测序结果表明臂长29 bp、茎环242 bp的SFB基因ihp RNA结构融合成功,双酶切检验和PCR验证结果表明,该结构正确地插入p CAMBIA-35S-MCS-NOS-NPTII的启动子和终止子之间,说明SFB基因的RNAi表达载体p CAMBIA-RNAi-SFB构建成功;PCR验证和测序结果也表明重组质粒已经成功转入农杆菌LBA4404中。【结论】研究结果表明,应用融合PCR结合酶切连接的方法构建SFB基因的RNAi表达载体是可行的,为RNAi技术在果树自交不亲和性状改良上的应用创造了条件。
- 刘海楠冯建荣罗明刘小芳李文慧白茹
- 关键词：自交不亲和
- 小白杏自交不亲和S-RNase基因RNAi表达载体的构建及遗传转化
- 2016年
- 为了应用RNAi技术调控杏自交不亲和性状,根据自交不亲和S66-RNase基因序列(Gen Bank登录中)设计特异引物,通过RT-PCR扩增S66-RNase基因(Gen Bank登录中)高变区及下游(63 bp)作为靶基因,构建RNAi表达载体的ihp RNA。以植物表达载体p CAMBIA为骨架载体,利用农杆菌介导的方法转化本氏烟,利用子房转化法转化小白杏。结果显示:获得了长度为439 bp的ihp RNA。表达载体酶切检验表明S66-RNase基因的RNAi表达载体构建和转入农杆菌LBA4404成功。通过抗性筛选和GUS染色检测,获得了16株阳性植株。结论:获得转基因烟草植株证明了本研究构建的RNAi植物表达载体有效,为诱导杏S-RNase基因转录后基因沉默、获得自交亲和的杏提供参考。
- 刘小芳冯建荣刘海楠罗明郭明星谢晓婷
- 关键词：S-RNASE基因烟草
- ‘库尔勒香梨’SFBB-γ基因全长的克隆与序列分析
- 2018年
- 【目的】克隆新疆特色梨品种‘库尔勒香梨’花粉SFBB-γ基因全长序列,为梨亚科SFBB基因的功能鉴定提供更多的依据,为进一步探索自交不亲和机制、培育自交亲和品种奠定分子基础。【方法】以新疆轮台国家果树资源圃采集的‘库尔勒香梨’花粉为材料,参考NCBI上已登录的‘库尔勒香梨’SFBB基因(GQ456943)序列,自行设计6对基因特异性引物和8条RACE巢式引物,筛选合适的引物并通过RT-PCR和RACE技术克隆SFBB-γ基因全长,用DNAMAN软件预测其氨基酸序列,并通过ProtParam等在线预测软件对其进行生物信息学分析;选取NCBI上已登录的全部蔷薇科梨亚科SFBB基因以及部分蔷薇科李属自交不亲和SFB基因的全长序列,用Clustal X软件进行多重比对并用MEGA 4.0构建系统进化树。【结果】从自行设计的6对基因特异性引物和8条RACE巢式引物中,筛选出2对基因特异性引物:[B3F (5’-TCATCCTCCACTTGTATC-3’)/B3R (5’-TAAATCCGTCATCGTAG-3’);B6F (5’-ATGTCTCAGGTGCGTGAAAGTG-3’)/B6R (5’-TAAATCCGTCATCGTAG-3’)]和2条RACE巢式引物:[Outer3 (5’-AACTATTGTACCGTTTCTAAAGGATGG-3’)/Inner5 5’-ATGGGTAATGGACTACGATG-3’)],并通过RT-PCR和RACE技术,成功克隆到1个全长为1 227 bp的SFBB-γ基因(GenBank登录中)。该基因包含1个完整的开放阅读框,长度为1 191 bp,编码396个氨基酸。ProtParam等在线软件预测该蛋白为不稳定亲水性非分泌蛋白,主要参与转运和结合等能量代谢并在基质内起连接酶或裂合酶的作用。聚类分析发现,在69个与蔷薇科花粉自交不亲和性有关的基因中,SFBB基因与SFB基因明显地分成2类;在SFBB基因类中,梨属SFBB-α基因和SFBB-β基因聚成一亚类,其中包括苹果的4个SFBB基因和3个SFLB基因,而梨属SFBB-γ基因则单独聚成另一亚类。【结论】获得了‘库尔勒香梨’花粉SFBB-γ基因c DNA全长序列,该基因由1个F-box区和4个可变区(V1、V2、V3、V4)组成,全长1 127 bp,包�
- 吕文娟刘海楠刘小芳李文慧冯建荣
- 关键词：自交不亲和性RACE
- 库尔勒香梨自交不亲和SFBB-γ基因F-box区和可变区V3 RNAi表达载体的构建及遗传转化
- 2018年
- 目的为在分子水平应用RNAi(RNA interference)技术调控梨自交不亲和性状,培育自交亲和梨品种。方法基于本实验室获得的库尔勒香梨(Pyrus bretschneideri Rehd)自交不亲和品种花粉决定子SFBB-γ基因c DNA全长序列,选取SFBB-γ基因F-box区和可变区V3分别设计141 bp和120 bp的片段作为干扰序列,以棉花基因组DNA 242 bp的序列作为间隔片段,利用融合PCR (Fusion PCR)构建SFBB-γ基因发卡结构(intron-containing hairpin RNA,ihpRNA),酶切后与pCAMBIA1304植物表达载体相连,构建SFBB-γ基因RNAi表达载体并转化至农杆菌GV3101中。利用叶盘转化法转化到库尔勒香梨无菌叶片中,用GUS组织化学染色法鉴定侵染叶片。测序结果表明干扰F-box区获得的ihpRNA臂长为141 bp,茎环253 bp;干扰可变区V3获得的ihpRNA臂长为120 bp,茎环253 bp。结果说明SFBB-γ基因F-box区和V3区的ihpRNA结构融合成功。通过双酶切检验及PCR证实,SFBB-γ基因F-box区和V3区的RNAi表达载体p CAMBIA1304-RNAi-SFBB构建成功; PCR验证和测序结果也表明重组质粒已经成功转入农杆菌GV3101中,GUS染色检验获得蓝色,目的基因已整合进入库尔勒香梨叶片中。结论成功构建库尔勒香梨SFBB-γ基因F-box区及可变区V3的RNAi表达载体,为诱导香梨SFBB-γ基因转录后基因沉默及培育自交亲和梨品种提供参考。
- 钟颖冯建荣刘海楠李文慧吕文娟田雯
- 关键词：库尔勒香梨自交不亲和F-BOX
- 2个中亚杏S-RNase基因全长的克隆与序列分析被引量：4
- 2015年
- 【目的】克隆中亚杏(Prunus armeniaca)品种自交不亲和花柱S-RNase基因全长序列,为分子手段调控杏自交不亲和性状奠定基础。【方法】以新疆栽培杏品种‘索格佳娜丽’和‘赛买提’为试材,利用RT-PCR克隆2个品种的花柱SRNase基因c DNA片段,RACE技术进行c DNA全长克隆,采用BLAST进行序列比对,Protparam软件分析2个基因的编码蛋白特性,MEGA 5.0构建进化树。【结果】从‘索格佳娜丽’中克隆了S_(52)-RNase(KF951503)基因,从‘赛买提’中克隆了一个新的S_(53)-RNase(KF975455)基因DNA和c DNA全长序列。S_(52)-RNase的DNA全长2 200 bp,c DNA全长765 bp,ORF(开放阅读框)长681 bp,编码226个氨基酸;S_(53)-RNase的DNA全长1 664 bp,c DNA全长907 bp,ORF长732 bp,编码242个氨基酸。BLASTP比对显示:这2个基因都具有保守的RNase-T2基因结构,属于RNase-T2家族。预测相对分子质量分别为26.5 ku和27.5 ku,等电点为9.36和9.03,都属于亲水性蛋白。进化分析表明,S_(52)与李(Prunus salicina,S_7)、S_(53)与大岛樱(Prunus speciosa,S_(13))亲缘关系最近,S_(52)和S_(53)处在2个不同的分支上,表现出较高的序列多态性,表明2个基因亲缘关系较远。【结论】获得了2个中亚杏品种自交不亲和花柱S-RNase基因全长序列。
- 李亚兰刘小芳刘海楠李文慧冯建荣
- 关键词：自交不亲和S-RNASE基因RACE
- ‘小白杏’自交不亲和SFB基因的克隆及其表达载体的构建
- 2015年
- 【目的】利用基因工程技术改良杏自交不亲和性状,为培育自交亲和杏品种奠定基础。【方法】以新疆自交不亲和杏品种‘小白杏’(Prunus armeniaca L.‘Xiaobaixing’)的花粉为材料,通过RT-PCR(Reverse Transcription PCR)和3’RACE(Rapid Amplification of c DNA Ends)技术克隆SFB基因(S-haplotype-specific F-box protein)片段。以克隆载体p MD19-T为基础,结合p BS-T上的酶切位点,利用酶切连接的方法将SFB基因的ORF框正向重组到表达载体p CAMBIA-35S-MCS-NOS-NPTII的Kpn I和Sac I酶切位点之间,构建SFB基因正义表达载体p CAMBIA-S-SFB;将SFB基因的ORF框反向重组到表达载体的Kpn I和Sal I酶切位点之间,构建SFB基因反义表达载体p CAMBIA-A-SFB;用电击转化法将重组质粒转化至农杆菌菌株(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404中。【结果】通过RT-PCR和RACE技术获得了1136 bp SFB基因片段(Gen Bank登录中),其中含912 bp ORF框(Open Reading Frame),由它推导的氨基酸序列与蔷薇科SFB基因高度同源,具有F-box结构域、2个变异区和2个高变区的完整结构;表达载体酶切检验结果表明,SFB基因的ORF框正确地插入p CAMBIA-35S-MCS-NOS-NPTII的启动子和终止子之间,表明SFB基因的正、反义表达载体构建成功;特异引物PCR验证结果也表明重组质粒已经成功转入农杆菌LBA4404中。【结论】研究的结果为利用基因工程技术改良杏自交不亲和性状、培育自交亲和杏品种的遗传转化提供了载体。
- 刘海楠冯建荣李文慧罗明刘小芳孙军利
- 关键词：自交不亲和
- '小白杏'自交不亲和SFB基因的克隆及其RNAi表达载体的构建
- '小白杏'(Prunus armeniaca L.'Xiaobaixing')是起源于新疆的著名杏品种之一,早熟且具有良好的外观和内在品质,其自交不亲和性极大地影响了产量和经济价值.目前对...
- 刘海楠冯建荣罗明刘小芳李文慧白茹
- 关键词：自交不亲和
- ‘库尔勒香梨’自交不亲和S-RNase等位基因全长的克隆与分析被引量：6
- 2017年
- ‘库尔勒香梨’是新疆重点发展的特色果树品种之一,具有自交不亲和性。本研究以新疆轮台国家果树资源圃栽培梨品种‘库尔勒香梨’为试材,利用梨S基因的保守序列设计合成的引物:‘FTQQYQ’/‘antiIIWPNV’初步确定‘库尔勒香梨’S-RNase等位基因型后,设计等位基因特异性引物,利用RT-PCR克隆两个花柱S-RNase等位基因cDNA片段,RACE(cDNA末端快速扩增)技术进行cDNA全长克隆,采用BLAST进行序列比对,Protparam等在线软件分析两个S-RNase等位基因的编码蛋白特性。根据NCBI上已登录的63条梨属S-RNase基因的全长序列,用DNAMAN软件对其氨基酸序列进行比对并用MEGA 4.0构建进化树。本试验从‘库尔勒香梨’中克隆得到了S_(22)-RNase(Gen Bank接受号:KX214125)/S_(28)-RNase(Gen Bank接受号:KX214124)等位基因cDNA的全长序列,为分子手段调控梨自交不亲和性状奠定了基础。S_(22)-RNase基因cDNA全长904 bp,ORF(开放阅读框)长684 bp,编码227个氨基酸;S_(28)-RNase基因cDNA全长921 bp,ORF长687 bp,编码228个氨基酸。BLASTP比对显示,这两个基因都具有保守的RNase-T2基因结构,属于RNase-T2家族。预测相对分子质量分别为25.6 k D和25.9 k D,等电点9.36和9.30,都属于亲水性蛋白。进化分析表明,‘库尔勒香梨’的S_(22)-RNase和S_(28)-RNase处在不同的两个分支上,表明两基因亲缘关系较远。
- 吕文娟冯建荣刘小芳刘海楠李文慧钟颖
- 关键词：库尔勒香梨自交不亲和S-RNASE基因
- 引入新疆的10个苹果种质资源果实褐变与酚类物质比较
- 分析引入新疆的10个苹果种质资源在粗放管理条件下的果实褐变程度、酚类物质含量的变化及差异,以期为筛选高品质加工品种提供科学依据。引种的10个苹果品种为‘锦红''''、‘红魁''''、‘吉早红''''、‘夏红''''、‘麦...
- 李淑玲刘海楠冯建荣李亚兰鲁晓燕樊新民
- 关键词：苹果酚类物质褐变
- 文献传递
- '库尔勒香梨'SFBB-γ基因全长的克隆与序列分析
- [目的]克隆新疆特色梨品种'库尔勒香梨'花粉SFBB-γ基因全长序列,为梨亚科SFBB基因的功能鉴定提供更多的依据,为进一步探索自交不亲和机制、培育自交亲和品种奠定分子基础.[方法]以新疆轮台国家果树资源圃采集的'库尔勒...
- 吕文娟刘海楠刘小芳李文慧冯建荣
- 关键词：自交不亲和性RACE
