李勇
- 作品数：6 被引量：17H指数：2
- 供职机构：中山大学附属第一医院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 人单纯疱疹病毒1型VP22介导的microdystrophin重组腺病毒的构建及其蛋白转导特性被引量：2
- 2008年
- 目的构建含有人单纯疱疹病毒1型(HSV-1)VP22与人microdystrophin基因融合的重组腺病毒,体外感染成肌细胞C2C12,探讨VP22对microdystrophin基因在成肌细胞中的蛋白转导特性。方法设计引物,从质粒pSIN-rep5-VP22中扩增VP22全长基因,然后将VP22基因定向插入腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV,获得重组质粒pCMV-VP22;再用NotⅠ酶切含microdystrophin基因的pBSK-micro质粒,获得microdystrophin基因,片段回收后定向插入重组质粒pCMV-VP22,获得重组质粒pCMV-VP22-MICDYS。PmeI线性化重组质粒pCMV-VP22-MICDYS,去磷酸化后回收与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1共电转化BJ5183感受态细胞。同源重组后用选择性培养基筛选阳性克隆,提取质粒,脂质体介导转染293细胞,通过观察293细胞病变及PCR扩增目的基因等方法鉴定重组腺病毒。将含VP22-microdystrophin及microdystrophin的病毒上清分别转染成肌细胞C2C12,通过RT-PCR、Western-blot和免疫组织化学方法检测microdys-trophin的mRNA及蛋白表达。结果成功构建了含有VP22-microdystrophin基因的重组腺病毒,体外感染成肌细胞C2C12,Western-blot及免疫组织化学检测显示VP22显著提高了microdystrophin蛋白在C2C12细胞中的表达。结论含有VP22-microdystrophin基因的重组腺病毒载体的构建及VP22介导microdystrophin在成肌细胞C2C12间的转导,为利用此病毒进行假肥大型肌营养不良症疾病的治疗研究奠定了基础。
- 熊符张成郑卉肖少波潘永飞许勇峰刘正山李勇
- 关键词：腺病毒假肥大型肌营养不良症
- 杆状病毒转导不同哺乳动物骨髓来源间充质干细胞被引量：5
- 2008年
- 杆状病毒作为一种新型基因载体,若能有效转导不同哺乳动物骨髓来源间充质干细胞(bone marrow-derived mesen-chymal stem cells,BMSCs),将会成为干细胞基因修饰研究领域中更理想的一种基因载体。本文探讨了重组杆状病毒(BacV-CMV-EGFP)对不同哺乳动物BMSCs的转导效率。体外原代培养小鼠、大鼠、猪、恒河猴及人的BMSCs。用培养3代以上的哺乳动物BMSCs进行病毒转导实验,转导2d后用倒置荧光显微镜观察绿色荧光蛋白在不同哺乳动物BMSCs中的表达,并用流式细胞仪检测重组杆状病毒对不同哺乳动物BMSCs的转导效率。结果显示:原代培养的小鼠、大鼠、猪、恒河猴及人的BMSCs于体外传代3次以上后,细胞呈现较均一的梭形,漩涡状生长;倒置荧光显微镜观察显示,与小鼠、大鼠、猪的BMSCs相比,恒河猴及人有更多BMSCs表达绿色荧光蛋白,且荧光强度较强;杆状病毒对小鼠、大鼠、猪、恒河猴及人的BMSCs的转导效率分别为(21.21±3.02)%﹑(22.51±4.48)%﹑(39.13±5.79)%﹑(71.16±5.36)%及(70.67±3.74)%。上述结果表明,重组杆状病毒对不同哺乳动物BMSCs的转导效率不同,对恒河猴及人的BMSCs转导效率较高,说明重组杆状病毒可作为人或灵长类动物BMSCs基因修饰研究领域中更理想的基因载体。
- 刘正山张成卢锡林李勇许勇峰熊符冯善伟李玲
- 关键词：杆状病毒转导绿色荧光蛋白
- Wnt3a转染小鼠胸腺激酶缺陷细胞及对β-连环素蛋白亚细胞分布的影响被引量：1
- 2010年
- 背景:Wnt信号通路是动物胚胎发育过程中重要的调控通路,建立Wnt信号通路细胞模型对于研究该通路有重要意义。目的:以Wnt3a真核表达质粒转染小鼠胸腺激酶缺陷细胞,构建能够持续激活Wnt信号通路的体外细胞模型,观察经典Wnt信号通路对β-连环素蛋白亚细胞分布的影响。方法:将扩增真核表达质粒pgk-Wnt3a-pcDNA3.0进行酶切鉴定。应用脂质体转染技术将真核表达质粒pgk-Wnt3a-pcDNA3.0和对照质粒pgk-neo-pcDNA3.0转染入胸腺激酶缺陷细胞,经过G418筛选后挑出细胞克隆,扩大培养。应用RT-PCR技术检测表达产物,应用间接免疫荧光技术检测Wnt3a对鼠胸腺激酶缺陷细胞β-catenin亚细胞分布的影响。结果与结论:Wnt3a质粒经过酶切鉴定证明所扩增的质粒为目的质粒。经过G418筛选3周后,挑选10个稳定转染的细胞克隆,进行RT-PCR检测,可见在L-Wnt3a细胞的cDNA产生1条长度为320bp亮带,表明扩增产物为所需要的目的片段,Wnt3a质粒转染胸腺激酶缺陷细胞后有Wnt3a在mRNA转录水平表达。转染对照质粒的胸腺激酶缺陷细胞cDNA未扩增出目的条带。免疫荧光检测可见Wnt3a质粒转染胸腺激酶缺陷细胞后细胞浆中有Wnt3a蛋白表达,转染对照质粒组无表达。Wnt3a质粒转染胸腺激酶缺陷细胞核中可见明亮的红色荧光,提示β-连环素蛋白在胸腺激酶缺陷细胞-Wnt3a细胞聚集并进入细胞核中。转染对照质粒的胸腺激酶缺陷细胞浆未见有明显β-连环素蛋白着色,细胞核中无β-连环素蛋白的聚集。构建了能够持续激活Wnt信号通路的体外细胞模型,真核表达Wnt3a质粒转染胸腺激酶缺陷细胞能够获得稳定表达,促进胸腺激酶缺陷细胞浆中β-连环素蛋白向细胞核转移。
- 尚延昌王淑辉张成熊符李勇刘正山许勇峰
- 关键词：WNT3A
- Microdystrophin基因修饰后的自体脂肪干细胞左心房移植治疗DMD模型鼠的实验研究
- 目的带有microdystrophin基因的重组杆状病毒转导DMD模型鼠(mdx鼠)脂肪干细胞是否会改变其细胞特性,且经microdystrophin基因修饰后的脂肪干细胞自体左心房移植后是否能到达mdx鼠全身各病变肌组...
- 刘正山冯善伟李勇许勇峰张成
- 文献传递
- 胆囊切除术与幽门螺杆菌感染关系的研究被引量：9
- 2004年
- 目的 探讨胆囊切除术与幽门螺杆菌感染的关系。方法 研究组为胆囊结石胆囊炎患者 111例 ,与研究组相匹配的有上消化道症状而无胆囊结石的患者 5 77例作为对照组 ,所有患者均行13 C呼气试验 ,以检查胃内活动性幽门螺杆菌 (Hp)感染 ,比较胆囊结石组和对照组人群Hp感染率。胆囊结石组中Hp阳性患者术后均行一疗程根治Hp治疗 ,随访 3～ 6个月。结果 胆囊结石组Hp感染率为 4 5 .9% ,对照组Hp感染率为 2 7.4 % ,前者明显高于后者 (P<0 .0 1) ;胆囊切除术后Hp阳性患者根治Hp治疗后随访 3～ 6个月 ,均未见明显的上腹部隐痛、饱胀不适等症状。结论 胆囊结石胆囊炎患者Hp感染率较高 ,Hp可能是引起“胆囊切除术后综合征”的因素之一 。
- 黄成吴志棉郑朝旭李勇谭敏樊嘉
- 关键词：胆囊切除术幽门螺杆菌感染胆囊结石胆囊炎
- 促红细胞生成素在瓣膜置换手术中的应用
- 目的：评价促红细胞生成素在瓣膜置换手术中应用的临床意义和安全性。方法：对三组条件相似的择期行瓣膜置换手术的风湿性心脏病患者共36例进行了前瞻性研究。治疗 A 组(14 例)手术前5～7天,手术前3天,手术前1天,手术后1...
- 张希李勇许哲
- 文献传递
