付金奇
- 作品数：9 被引量：21H指数：3
- 供职机构：青岛农业大学动物科技学院更多>>
- 发文基金：艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治专项国家科技重大专项更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学农业科学更多>>
- H1N1亚型流感病毒NA基因在昆虫杆状病毒系统中的表达及鉴定
- 2013年
- 目的构建含有H1N1亚型流感病毒NA基因的重组杆状病毒。方法用PCR方法扩增甲型H1N1亚型流感病毒（A／PR8／34）全长神经氨酸酶基因，并将其连接于pFastBacdual载体，构建杆状病毒转移载体pFBD-NA。转化含有Bacmld的DHl0B感受态细胞后，获得重组穿梭载体rBacmid—NA。将其转染昆虫细胞sf9，获得重组病毒rBac—NA。提取重组杆状病毒rBac—NA的DNA并使用PCR方法检测；采用间接免疫荧光，SDS-PAGE，WesternBlot鉴定以及ELISA方法检测所表达的NA蛋白。结果经PCR鉴定所构建质粒rBacmid—NA正确；使用间接免疫荧光检测可见特异性绿色荧光位于感染细胞的表面，WesternBolt检测可与小鼠抗PR8株多克隆抗体和兔抗甲型流感病毒NA多克隆抗体发生特异性免疫反应；经ELISA检测，NA蛋白可被鼠抗流感病毒（PR8）多克隆抗体特异性识别。结论上述结果证明，我们获得了表达流感病毒NA蛋白的重组杆状病毒，为进一步研究NA蛋白的功能和新型流感疫苗的开发奠定了基础。
- 姚立红付金奇陈爱珺刘晓宇徐鹏卫郭建强张乐翠
- 关键词：正黏病毒科神经氨酸酶
- 可调控表达甲型流感病毒M2蛋白的哺乳动物细胞系的建立与鉴定被引量：5
- 2011年
- 甲型流感病毒M2蛋白是一种具有离子通道功能的跨膜蛋白,其氨基酸序列非常保守,可用于流感通用疫苗的研究。为了构建可调控的稳定表达甲型流感病毒M2蛋白的哺乳动物细胞系,首先应用PCR方法从含有流感病毒PR8株第七节段全长基因的质粒中扩增得到M2基因。将该片段亚克隆到真核表达载体pcDNA5/FRT/TO上,用BamHⅠ和NotⅠ双酶切鉴定正确后将重组质粒与表达Flp重组酶的pOG44质粒共转染Flp-In T-REx-293细胞,使目的基因整合到宿主细胞染色体。筛选具有Hygromycin B抗性的细胞株。在该细胞的培养基中加入四环素以诱导目的基因表达,48 h后通过间接免疫荧光方法检测到M2蛋白的表达。共得到16株高表达M2蛋白的重组细胞株,这些细胞株在传10代后仍能稳定表达目的蛋白。未加四环素诱导的细胞没有检测到M2蛋白,说明四环素调控系统严格控制着目的基因的表达。今后,该细胞系可用于流感病毒M2蛋白的功能研究、流感候选疫苗的免疫学评价以及流感病毒减毒活疫苗的研制。
- 刘晓宇郭建强姚立红陈爱珺付金奇张智清
- 关键词：甲型流感病毒四环素
- 甲型H_5N_1流行性感冒病毒基质蛋白2与基质蛋白1双基因载体疫苗的构建及其免疫学评价
- 2011年
- 目的构建表达甲型H5N1流行性感冒(流感)病毒基质蛋白(Matrix Protein,M)2(M2)与1(M1)基因的脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleic Acid,DNA)疫苗与腺病毒(Adenovirus,Ad)载体疫苗,将其联合免疫小鼠,对免疫效果进行评价。方法以中国分离的首株人H5N1亚型禽流感病毒(Avian Influenza Virus,AIV)[A(甲型)/Anhui(安徽)/1/2005]作为研究对象,聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)扩增全长M2和M1基因,构建共表达H5N1亚型AIVM2和M1基因的重组pStar-M2/M1。利用Ad-Easy载体系统,在293细胞中包装出表达M2基因的重组Ad-M2和表达M1基因的重组Ad-M1。按初次免疫-加强免疫程序,分别用重组pStar-M2/M1和重组Ad-M2+Ad-M1免疫BALB/c小鼠,共免疫4次,每次间隔14d。第1、3次用DNA疫苗,第2、4次用重组Ad疫苗,每次免疫前及末次免疫后13d采集血清,用于检测体液免疫应答。末次免疫后14d,以H1N1亚型流感病毒A/PuertoRico(PR,波多黎各)/8/34/株进行攻击。病毒攻击后14d内,逐日观察小鼠的存活及体重变化情况。结果用间接免疫荧光(Indirect Immunofluorescence Assay,IFA)方法检测到了重组pStar-M2/M1、Ad-M2、Ad-M1载体上相应插入基因的表达,将其联合免疫小鼠后,酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked Immunosorbent Assay,ELISA)检测到小鼠血清中的抗H5N1亚型流感病毒M2、M1的IgG抗体。病毒攻击实验结果表明,免疫后小鼠对流感病毒A/PR/8/34(H1N1)株的攻击有一定的交叉保护作用。结论成功构建了表达甲型H5N1流感病毒M2与M1基因的DNA疫苗与重组Ad疫苗,联合免疫小鼠后刺激产生了特异性的体液免疫应答,并对异源毒株具有一定的交叉保护作用。
- 郭建强姚立红陈爱珺刘晓宇付金奇张智清
- 关键词：联合免疫
- H5N1亚型流感病毒M2与NA基因真核表达载体的构建与鉴定
- 2011年
- 目的 构建表达H5N1亚型流感病毒M2和NA基因的多种真核表达载体.方法 以我国分离的首株人H5N1亚型禽流感病毒（A/Anhui/1/2005）作为研究对象,PCR扩增全长M2与NA基因.将M2基因克隆入真核表达载体pStar的IRES上游或下游的MCS,构建重组pStar-M2/和pStar-/M2.将NA基因克隆人pStar载体IRES上游或下游的MCS,构建重组pStar-NA/和pStar-/NA.将M2和NA基因先后克隆到pStar载体IRES序列的上游和下游MCS,分别构建双基因共表达重组pStar-M2/NA和pStar-NA/M2.将重组质粒转染293细胞,使用IFA方法 检测各重组质粒相应外源基因的表达.结果 通过酶切鉴定,各重组质粒构建正确.将其转染293细胞后,使用IFA方法 检测到了各重组质粒中相应外源基因的表达.结论 构建了多种表达H5NI亚型流感病毒M2和（或）NA基因的真核表达载体,为研究开发流感DNA疫苗奠定了基础.
- 郭建强姚立红陈爱珺刘晓宇付金奇徐鹏卫张智清
- 关键词：流感病毒A型病毒蛋白质类神经氨酸酶
- H1N1亚型流感病毒M1基因重组杆状病毒的构建及鉴定被引量：1
- 2012年
- 目的构建H1N1亚型流感病毒M1基因重组杆状病毒,并进行鉴定。方法 PCR扩增H1N1亚型流感病毒(A/PR/8/34)全长M1基因,与pFastBacdua(lpFBD)载体连接,构建重组杆状病毒转移载体pFBD-M1,转化含有Bacimd和Helper质粒的DH10Bac感受态细胞,获得骨架质粒rBacmid-M1,将其转染sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒rBac-M1。采用噬斑形成法检测病毒滴度,PCR法检测M1基因的插入,间接免疫荧光、Western blot和ELISA法检测M1蛋白的表达。结果重组杆状病毒骨架质粒rBacmid-M1经PCR鉴定证实构建正确;第3代rBac-M1病毒滴度为3×108pfu/ml;感染rBac-M1的sf9细胞经PCR扩增可见3 300 bp的条带,间接免疫荧光检测可见特异性绿色荧光,Western blot检测可与鼠抗流感病毒(PR8)和鼠抗M1蛋白(PR8)多克隆抗体发生特异性反应,ELISA检测M1蛋白可与鼠抗流感病毒(PR8)多克隆抗体发生特异性反应,具有良好的反应原性。结论已成功构建了H1N1亚型流感病毒M1基因重组杆状病毒,为进一步研究流感病毒M1的功能及新型流感疫苗开发奠定了基础。
- 郭建强付金奇姚立红陈爱珺徐鹏卫殷继永张智清
- 关键词：流感病毒杆状病毒SF9细胞基因表达
- 甲型流感病毒血凝素基因在昆虫杆状病毒系统中的表达被引量：7
- 2011年
- 目的利用昆虫杆状病毒系统表达甲型流感病毒血凝素(Hemagglutinin,HA)蛋白。方法 PCR扩增去除信号肽的甲型H1N1(A/PR/8/34)流感病毒HA基因,与pFastBacdual载体(pFBd)连接,构建转移载体pFBd-HA,转化含Bacmid的DH10Bac感受态细胞,获得穿梭质粒rBacmid-HA。rBacmid-HA转染sf9昆虫细胞,获得重组病毒rBac-HA。采用噬斑形成法检测病毒滴度,PCR法检测重组杆状病毒基因组HA基因,间接免疫荧光法、Western blot法和ELISA法检测HA蛋白的表达。结果穿梭质粒rBacmid-HA经PCR鉴定构建正确;第3代rBac-HA的滴度为3×107 pfu/ml;感染rBac-HA的sf9细胞经PCR扩增可见4 216 bp的特异性条带,间接免疫荧光检测可见绿色荧光,Western blot鉴定与鼠抗甲型流感病毒HA(H1)单抗和鸡抗流感病毒(California株)多抗发生特异性反应,ELISA检测与鼠抗流感病毒(PR8株)多抗特异性结合的能力强于与鸡抗流感病毒(California株)多抗结合的能力。结论 利用昆虫杆状病毒表达系统成功表达了甲型流感病毒HA蛋白。
- 付金奇郭建强姚立红陈爱珺刘晓宇张乐萃张智清
- 关键词：杆状病毒SF9细胞
- 共表达H5N1流感病毒M1和HA基因的DNA疫苗与腺病毒载体疫苗的小鼠免疫评价(英文)被引量：7
- 2011年
- 为评价在小鼠体内表达流感病毒M1和HA基因诱导的免疫反应,制备共表达H5N1亚型禽流感病毒(A/Anhui/1/2005)全长基质蛋白1(M1)基因和血凝素(HA)基因的重组DNA疫苗pStar-M1/HA和重组腺病毒载体疫苗Ad-M1/HA,将其按初免-加强程序免疫BALB/c小鼠,共免疫4次,每次间隔14 d。第1、3次用DNA疫苗,第2、4次用重组腺病毒载体疫苗,每次免疫前及末次免疫后14 d采集小鼠血清用于检测体液免疫应答,末次免疫后14 d采集小鼠脾淋巴细胞用于检测细胞免疫应答。血凝抑制(HI)实验和ELISA实验检测到免疫后小鼠血清中抗H5N1亚型流感病毒特异性IgG抗体。ELISPOT实验检测到免疫后小鼠针对M1和HA的特异性细胞免疫应答。共表达H5N1流感病毒M1和HA基因的DNA疫苗与腺病毒载体疫苗在小鼠体内的免疫学评价,为研究开发新型重组流感疫苗奠定了基础。
- 郭建强姚立红陈爱珺刘晓宇付金奇徐鹏卫张智清
- 关键词：共表达联合免疫
- 稳定表达甲型流感病毒血凝素蛋白的哺乳动物细胞系的建立被引量：2
- 2011年
- 目的建立稳定表达甲型流感病毒血凝素(Hemagglutinin,HA)蛋白的哺乳动物细胞系。方法 PCR扩增流感病毒(A/PR/8/34)全长HA基因,并将其克隆入真核表达载体pcDNA5/FRT(pDF)中,构建重组表达质粒pDF-HA,将其与表达Flp重组酶的pOG44质粒共转染Flp-In-CHO细胞,通过体内同源重组使目的基因整合至宿主细胞染色体上。采用Hygromycin B持续压力筛选重组细胞系CHO-HA,通过间接免疫荧光法(IFA)和Western blot法检测HA蛋白的表达。重组细胞连续培养10代后,采用PCR和IFA法检测细胞中HA的基因遗传和蛋白表达的稳定性。结果重组表达质粒pDF-HA经双酶切及测序,证实构建正确;通过Hygromycin B抗性及IFA,共筛选出20株高表达HA蛋白的重组细胞株,Western blot结果进一步证实,HA蛋白在重组细胞中获得表达,并被切割成HA1和HA2蛋白;连续培养10代后,PCR与IFA方法分别检测到重组细胞HA基因和蛋白的表达。结论已成功建立了稳定表达甲型流感病毒HA蛋白的哺乳动物细胞系,为针对HA蛋白和流感病毒的免疫学检测以及HA蛋白的功能研究提供了靶细胞。
- 郭建强陈爱珺姚立红刘晓宇付金奇徐鹏卫张智清
- 关键词：哺乳动物细胞
- 人H5N1流感病毒M1基因的亚克隆及其在原核细胞的表达被引量：1
- 2011年
- 目的 构建人H5N1亚型禽流感病毒A/Anhui/1/2005 M1蛋白的原核表达系统，为进一步研究M1蛋白的生物学功能和制备其诊断试剂奠定基础。方法 以该病毒基因节段七cDNA为模板，PCR扩增得到M1基因片段。将该片段亚克隆至载体pQE80-L中，构建重组质粒pQE80-L/M1，转化大肠埃希菌BL21（ DE3）。IPTG诱导重组蛋白表达。金属镍离子螯合层析纯化N末端携带多聚组氨酸标签的重组M1蛋白，免疫小鼠制备多克隆抗体。结果 获得了重组M1蛋白，能与抗H5N1亚型流感病毒血清发生特异性结合，且其免疫后能诱导机体产生特异性抗体。结论 成功获得了人H5N1亚型禽流感病毒M1蛋白在原核细胞中高效表达。
- 陈爱珺郭建强姚立红程从升刘晓宇付金奇徐鹏卫张智清
- 关键词：流感病毒A型基因基因表达
