郭斯启
- 作品数：47 被引量：89H指数：5
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- 发文基金：国家自然科学基金中国博士后科学基金军队医药卫生科研基金更多>>
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- 新型重组IL6D24PE40KDEL外毒素融合蛋白的理化分析
- 2004年
- 为了对构建成功的新型重组IL6D2 4 PE4 0KDEL外毒素融合蛋白的部分物化表征进行分析鉴定 ,采用Edman法、SDS PAGE法、胰蛋白酶消化的MALDI TOF MS质谱法、蛋白印迹法和MTT法分别测定该融合蛋白的N 末端 6个氨基酸、相对分子量、肽谱、抗原特异性以及靶向杀伤生物学活性。结果表明 :所构建表达纯化的新型重组IL6D2 4 PE4 0KDEL外毒素融合蛋白N末端 6个氨基酸序列为Met Ile Asp Lys Gln Ile ,而IL 6缺失 2 4个氨基酸后的原序列为Ile Asp Lys Gln Ile ,由于采用了大肠杆菌表达系统 ,因此在N末端第 1位多出了 1个Met,经12 %SDS PAGE蛋白电泳和凝胶成像系统分析计算 ,其相对分子量为 5 8.75kD ,与理论值 5 6.9kD相比误差在5 %之内。MALTI TOF MS质谱测定共获得 10个与理论预测值相符的肽段 ,经瑞士生物信息研究所的EXPASY分子生物服务网站的Peptident数据库搜索证明 ,在分子量为 5 7kD左右的范围内未检索到与上述条件相符的已知蛋白 ,证明本融合蛋白为全新蛋白 ,与预测的目的蛋白相符。WB实验显示IL6D2 4 PE4 0KDEL外毒素融合蛋白能与IL 6及PEA抗体特异性结合。MTT生物活性测定表明 ,该融合蛋白对表达IL 6R的多发性骨髓瘤细胞系U2 66产生特异性杀伤 ,而对不表达IL6R的CEM淋巴细胞系无任何杀伤。结论
- 崔建武郭斯启孙玉英刘楠梁飞奚永志
- 关键词：纯化鉴定
- 特异性表达新霉素耐药基因Neo^R的人乳腺癌细胞模型的建立被引量：1
- 1999年
- 将含有ＮｅｏＲ基因的ｐＳＶ２－ｎｅｏ质粒经扩增、提取及纯化，以磷酸钙共沉淀法转染入ＭＤＡ人乳腺癌细胞系，经Ｇ４１８长期高压筛选出７株抗性ＭＤＡ细胞克隆，采用ＮｅｏＲ基因特异性引物进行聚合酶链反应，证实了ＮｅｏＲ基因在各株Ｇ４１８抗性ＭＤＡ细胞基因组中的整合。ＭＤＡ－ＮｅｏＲ细胞在传代６个月之后仍可耐受６００ｍｇ／Ｌ高浓度的Ｇ４１８，说明ＮｅｏＲ基因导入后的整合及表达是稳定的。表明已初步建立了携有特异标志基因ＮｅｏＲ的人乳腺癌细胞模型。
- 郭斯启奚永志宋三泰金荔陈兴国孔繁华
- 关键词：乳腺癌基因表达新霉素耐药基因
- GVHD病因学的新视野:HLA分子三维结构研究被引量：1
- 2000年
- 目的 :进一步探索GVHD的发病机理 ,提高临床移植疗效。方法 :采用国际通用的微量淋巴细胞毒试验和混合淋巴细胞培养方法 ;基因分型采用PCR SSP方法 ,对基因亚型进行DNA测序 ,再进行HLA三维结构模拟。结果 :① 4名骨髓移植患者中 ,例 1供 受体间HLA Ⅰ、Ⅱ类血清学分型相合 ,DQB1基因亚型不同 ,例 2、3、4均有 1个Ⅰ类抗原 (分别为HLA A、B和A)血清学分型不合和 1个基因亚型不同。HLA三维结构模拟例 1、3、4供 受者差别明显 ,骨髓移植后发生了Ⅲ～Ⅳ度GVHD ;例 2三维结构模拟差别不明显 ,仅发生Ⅰ度GVHD ;② 4个病例供 受体间HLA分子分别相差 14、17、2 0、12个氨基酸 ,相差数量与GVHD无相关性 ;3例重度GVHD供 受体的HLA分子三维结构均在抗原结合区的β转角处出现明显差异 ,而 1例轻度GVHD则无明显差异。 结论 :当异基因骨髓移植供 受体间HLA基因亚型不同时 ,移植后发生GVHD的程度与HLA分子三维结构差别大小有密切关系 ;三维结构的差别又与差异氨基酸所处的位置有关 ;GVHD与抗原氨基酸差别的数量多少没有直接关系。
- 孔繁华孙玉英奚永志任素萍金荔陈兴国刘楠屠敏郭斯启
- 关键词：人类白细胞抗原移植物抗宿主病骨髓移植
- 重组人G-CSF双体分子的构建表达及生物活性和结构特性分析
- 2003年
- 研究目的是分子设计并构建较G-CSF单体分子具有半衰期更长、生物活性更高的新型重组人G-CSF/G-CSF双体分子(简称G-G),并在原核系统进行高效表达。分别构建pET32/G-G和pET32/G原核表达载体,实现G-G双体融合蛋白在大肠杆菌中的高效表达,利用亲和层析等方法进行蛋白纯化;对该融合蛋白的结构特征诸如等电点、柔性、抗原性及亲水性进行模拟分析;采用MTT法对G-G双体融合蛋白的生物学活性进行测定。结果首次构建成功了G-G双体分子融合蛋白高效表达载体,表达量高于40％,一步亲和层析所获融合蛋白的纯度为80％左右。该融合蛋白的结构特征模拟分析的结果显示,G-CSF双体分子的等电点、柔性、抗原性及亲水性均未显著改变。活性测定表明,所构建表达的重组人G-G双体分子能有效刺激G-CSF依赖细胞株NFS-60的增殖,但其刺激效应低于G-CSF的单体和标准品。结果表明,所构建表达的G-CSF的单体和G-G双体分子均可在大肠杆菌中获得高效表达,但G-G双体分子的比活性不及G-CSF单体分子,与预期设想的有差别,其原因正在研究之中。
- 郭斯启奚永志赵丹丹孙玉英崔建武刘楠梁飞
- 关键词：大肠杆菌
- 新型重组免疫抑制融合毒素蛋白B7-2-PE40KDEL的表达优化被引量：2
- 2005年
- 目的:我们所研创的pRSETa-B7-2-PE40KDEL/BL21pLysE工程菌通常情况下更多的是以包涵体形式为主,而少部分为可溶形式,本研究试图在不改变其结构而仅通过优化各种已知影响原核表达系统的相关因素而获得稳定、高效的几乎全部以可溶性形式表达的重组B7-2-PE40KDEL融合蛋白。方法:针对更换不同的培养基、降低或升高诱导温度、增加或减少IPTG的用量、延长或缩短诱导时间等诸多能够增加可溶性表达量的各种因素进行较为系统的探索。结果:该工程菌在无压力选择条件下传代50代后的表达稳定性约为60%;通过大量对比研究,我们最终确定了pRSETa-B7-2-PE40KDEL/BL21pLysE菌种的最佳培养诱导表达方案:即过夜活化的菌种以2%浓度接种于2YT培养基,22℃培养至D值约为0.4时加入0.1mmol/LIPTG,诱导12h,由此可获得较高水平的、稳定的、几乎全部为可溶性表达的重组B7-2-PE40KDEL融合蛋白,目的蛋白量占菌体总蛋白的≥24%。结论:通过优化各种已知影响原核表达系统的相关因素,获得了稳定、高效的几乎全部以可溶性形式表达的重组B7-2-PE40KDEL融合蛋白的工程菌,为进一步有效分离纯化该蛋白奠定了基础。
- 关海容孙玉英袁志宏张惠丽梁飞刘楠郭斯启习彩霞奚永志
- 关键词：工程菌株免疫抑制基因表达
- 新霉素耐药基因(Neo^R)的整合与表达并不改变人乳癌细胞(MDA)的原有生物学特性
- 1999年
- 目的：通过对比ＭＤＡ－ ＮｅｏＲ 与ＭＤＡ 人乳癌细胞的生物学特征，阐明原核标志基因ＮｅｏＲ 的长期稳定整合与表达是否对乳癌细胞原有的生物学特性产生影响。方法：对已建立且证实表达ＮｅｏＲ 基因＞ ６ 个月的７ 株ＭＤＡ－ＮｅｏＲ 细胞系进行Ｇ４１８ 抗性、表面抗原、细胞倍增时间、细胞周期、肿瘤细胞集落形成及裸鼠体内成瘤能力的检测。结果：ＭＤＡ－ ＮｅｏＲ 细胞对高浓度的Ｇ４１８ 仍产生抗性并表达Ｎｅｏ Ｒ 基因；其细胞倍增时间、Ｓ 期分数、肿瘤细胞体外集落形成率与ＭＤＡ 无明显区别（ Ｐ＞ ０－０５） ；角蛋白ＣＫ１９ 与表面膜抗原ＥＭＡ 的表达在两组是等同的；并且ＭＤＡ－ ＮｅｏＲ ７ 细胞系在裸鼠体内的成瘤能力与ＭＤＡ 细胞也是相似的。结论：外源标志基因ＮｅｏＲ 的长期稳定整合与表达对ＭＤＡ
- 郭斯启奚永志宋三泰金荔陈兴国孔繁华
- 关键词：新霉素耐药基因
- 新型重组免疫抑制蛋白B7-2-L-PE40KDEL的分子构建与生物活性及结构特性被引量：5
- 2002年
- 目的 构建重组B7 2 L PE4 0KDEL融合蛋白 ,特异性杀伤CD2 8高表达的T细胞 ,选择性阻断T淋巴细胞活化过程中的B7:CD2 8/CTLA 4共刺激信号系统 ,由此诱导免疫耐受 ,特异性防治移植物抗宿主疾病 (GVHD)和宿主抗移植物疾病 (HVGD)。方法 采用基因融合序列重叠延伸 (SOE)策略 ,构建新型重组pRSETA B7 2 L PE4 0KDEL外毒素融合蛋白的原核表达载体 ,实现融合蛋白在大肠杆菌中的高效表达 ,利用亲和层析等方法进行蛋白质纯化。对该融合蛋白的结构特征诸如等电点、柔性等进行模拟分析。采用MTT法对其特异性杀伤高表达CD2 8受体的T细胞的活性进行测定。结果 构建并高效表达了B7 2 L PE4 0KDEL融合蛋白 ,所获融合蛋白的纯度大于 95 %。该融合蛋白的结构特征模拟分析的结果显示 ,其柔性及抗原性、亲水性表位均未显著改变。活性测定显示 ,该重组融合蛋白能有效特异性地杀伤高表达CD2 8的人T淋巴瘤细胞系 ,而对未表达CD2 8的人白血病细胞系则无任何杀伤。结论 具有靶向性免疫抑制活性的新型重组B7 2 L PE4 0KDEL外毒素融合蛋白的构建、表达对特异性防治GVHD和HVGD可能产生积极的影响。
- 袁志宏奚永志张惠丽孔繁华关海容郭斯启刘楠梁飞孙玉英崔建武
- 关键词：生物活性淋巴细胞转化移植物抗宿主病免疫耐受
- 预报预测GVHD的新策略HLA分子三维结构库的建立和临床应用研究
- 造血干细胞移植是治疗白血病的最有效的措施之一,移植后的GVHD发生直接影响移植效果,因此,移植前供受体HLA配型,选择适宜的供体是国际上研究的热点课题。为此,开展了HLA分子三维结构与GVHD相关性的研究。HLA分子三维...
- 孔繁华韩红星孙玉英奚永志郭斯启刘楠梁飞
- 文献传递
- 重组人干细胞因子在原核系统中高效表达的策略被引量：3
- 2004年
- 目的 探索并建立人干细胞因子 (SCF)的原核高效表达系统。方法 设计特异性引物 ,以RT PCR从人胎肝组织中扩增出干细胞因子的膜外区活性片段 ,克隆进入pGEM T载体。以Goldkey软件进行翻译起始序列RNA结构和自由能优化 ;通过合成寡核苷酸和PCR技术将SCFcDNA中的原核稀有密码子定点突变为同义的高频密码子 ;酶切连接构建多种原核表达载体并比较它们在宿主菌中诱导表达结果。表达产物经SDS PAGE、WesternBlot和MTT活性鉴定。结果 扩增SCF膜外区序列测定正确。构建的原核表达载体 pET32a(+) SCF在大肠杆菌中获得高效融合表达 ,表达产量达 30 %以上 ,WesternBlot鉴定正确 ,初步纯化产物的活性与标准品相似。结论 根据使用的载体 /宿主系统 ,翻译起始序列 (TIS)的RNA结构和自由能优化、稀有密码子突变对表达无影响 ;SCF基因在 5′端融合要比
- 郭斯启奚永志崔建武习彩霞刘楠梁飞孔繁华
- 关键词：干细胞因子大肠杆菌
- 在肾移植中找到HLA部分相合的供者难吗?
- 1998年
- 目的：说明肾移植中供受者之间ＨＬＡ配型的重要意义并探讨其可行性。方法：采用国际统一的方法，即补体依赖性微量淋巴细胞毒实验和微量淋巴细胞毒供受者交叉实验方法，对汉族人１０８例等待肾移植的病人和３７例供者的ＨＬＡ－Ａ、Ｂ、ＤＲ和ＤＱ位点进行抗原分型。结果：２、３、４、５和６个抗原相合者分别为１０７、１０６、８９、３７和２例，说明ＨＬＡ相合率地区实测值明显高于理论值。１例供受者间ＨＬＡ有３个抗原相合者，移植后１ｈ出现排尿反应，另１例全不合，移植后２４天内无排尿反应，移植失败。结论：ＨＬＡ相合与否对肾移植成败至关重要。在一个地区。
- 孔繁华陈兴国孙成文金荔郭斯启屠敏奚永志
- 关键词：肾移植HLA分型供者
