李冰清
- 作品数：22 被引量：19H指数：3
- 供职机构：山东省医学科学院更多>>
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- 相关领域：医药卫生生物学农业科学政治法律更多>>
- 不同毒力表型EV71 VP1氨基酸变异的研究被引量：2
- 2015年
- 目的研究EV71VP1上的变异位点(P639S/G),构建突变体拯救病毒,分析病毒突变前后在细胞上的复制差异性。方法采用反向遗传学方法,在EV71感染性全长cDNA的基础上构建突变体病毒的全长感染性cDNA,转染获得拯救病毒并传代验证;通过全基因测序,RT-PCR、Western blot、免疫荧光法检测拯救病毒,并绘制拯救病毒的生长曲线。结果 RT-PCR检测到EV71VP1特异性核酸片段,大小为227bp,与理论值相符;Western blot、免疫荧光检测到EV71特异蛋白;突变前后拯救病毒的生长曲线无明显改变。结论突变体病毒拯救成功且能稳定传代;EV71-P639变异不影响病毒的复制。
- 张亚杰李鹏岳盈盈宋楠楠李冰清李志会秦立增孟红
- 关键词：肠道病毒71型VP1
- 鼠伤寒沙门菌AvrA蛋白的原核表达及纯化被引量：3
- 2018年
- 目的克隆,表达和纯化沙门菌AvrA蛋白,为AvrA蛋白的结构和功能研究奠定基础。方法采用生物信息学方法对AvrA蛋白的性质进行预测。使用PCR的方法从沙门菌基因组上获得AvrA36-277基因,并克隆到原核表达载体pGl01上;使用大肠埃希菌BL21(DE3)菌株进行目的蛋白的表达,表达产物分别经镍离子亲和柱、阴离子交换柱以及凝胶层析柱层析纯化。结果成功获得重组质粒AvrA36-277/pGl01,转化BL21后经IPTG诱导获得分子质量单位约为27ku的重组AvrA36-277蛋白。该蛋白以可溶形式表达,层析纯化后蛋白浓度达5mg/ml,蛋白纯度95%。结论使用大肠原核表达系统可稳定表达沙门菌的AvrA36-277蛋白,该蛋白可溶性良好,获得蛋白纯度较高,可用于蛋白底物的筛选、晶体生长及三维结构解析。
- 杨银龙岳盈盈宋楠楠王玮玮马胡李翠玲李冰清
- 关键词：鼠伤寒沙门菌生物信息学原核表达
- 金属离子对重组深渊滕黄单胞菌低温α-淀粉酶LamA的活性和稳定性影响被引量：1
- 2019年
- 【背景】深渊藤黄单胞菌XH031 (Luteimonas abyssi XH031)是从深海分离到的一株具有很强淀粉降解能力的细菌,前期实验显示其α-淀粉酶LamA在低温环境下仍能保持较高酶活力。若能够提升其热稳定性,会有更好的应用前景。【目的】分析钙离子的存在对LamA热稳定性的影响,并通过钙离子结合位点的关键氨基酸的定点突变,初步明确其作用机制。【方法】在不同的离子条件下检测LamA的热稳定性,利用生物信息学方法预测可能影响钙离子结合及耐热性的氨基酸位点,对目的氨基酸进行定点突变,表达和纯化突变蛋白,并进行功能鉴定。【结果】钙离子明显提高了LamA的热稳定性:在未添加钙离子时,于65°C处理30 min已完全失活;而在5 mmol/L钙离子条件下,于65°C处理30 min后仍具有36%的酶活力。对预测位点进行定点突变后,突变蛋白D200R和H233D/M234C完全失活;N120D、Q185E和T224D活性降低。在未添加钙离子时,突变蛋白稳定性受高温影响程度与野生型差别不大;而在钙离子条件下,N120D在65°C时的酶活力仅为野生型的27.8%,推测位点Asn120与钙离子的结合能够稳定低温酶LamA在较高温度下的结构。【结论】初步明确了钙离子可提升低温α-淀粉酶LamA的热稳定性,为今后相关酶类的工程改造提供理论基础。
- 孙清扬张静静李冰清王岩张晓华
- 关键词：Α-淀粉酶
- 鼠伤寒沙门菌修饰酶YdiU的表达、纯化及晶体培养被引量：2
- 2019年
- 目的采用大肠埃希菌原核表达体系表达并纯化YdiU蛋白,筛选蛋白质晶体,为其结构和酶活测定等研究奠定基础。方法以生物信息学预测为基础,使用PCR方法从沙门菌基因组中调取ydiU基因,构建ydiU-pGl01重组质粒,转化入大肠埃希菌BL21(DE3)中,诱导蛋白表达。并使用镍离子亲和层析柱和阴离子交换柱对YdiU蛋白进行纯化。纯化后YdiU蛋白利用16种晶体筛选试剂盒在悬滴条件下进行晶体培养。结果成功构建重组表达质粒ydiU-pGl01。IPTG诱导后,YdiU蛋白在大肠埃希菌BL21(DE3)菌株中大量表达,并多以可溶形式存在。经镍离子亲和层析和阴离子交换法纯化后得到纯度较高的蛋白溶液,浓度为3.6 mg/ml,相对分子质量约51×10^3。纯化的YdiU蛋白在0.5 mol/L Potassium thiocyanate条件下长出蛋白晶体。结论采用大肠埃希菌表达系统可表达可溶性YdiU蛋白,YdiU蛋白在阴离子交换柱上表现为峰型对称的单峰,纯度较高,可用于蛋白质晶体的筛选,为进一步解析YdiU的结构和功能研究奠定了基础。
- 马玥杨银龙岳盈盈宋楠楠王玮玮贾海红李翠玲李冰清
- 关键词：鼠伤寒沙门菌表达纯化
- EV71 3C蛋白酶作用靶点检测试剂盒及检测方法
- 本发明公开了一种EV71？3C蛋白酶作用靶点检测试剂盒，包括3C蛋白、多肽底物，以及酶解反应缓冲液，所述3C蛋白的序列如SEQ？ID？NO.1所示；所述多肽底物为Dabcyl-EALFQGPPKFE-Edans。本发明还...
- 李冰清孟红秦立增李鹏李志会岳盈盈宋楠楠
- 肠道病毒71型激活小胶质细胞的实验研究被引量：1
- 2017年
- 目的研究肠道病毒71型(EV71)对小胶质细胞的活化作用。方法采用细胞病变法将EV71接种小胶质细胞(BV2),通过观察接种后不同时间的荧光强度,确定EV71对小胶质细胞的感染性,同时采用实时荧光定量PCR检测病毒基因组;应用Griess法和流式细胞术检测EV71激活小胶质细胞后一氧化氮(NO)和炎性细胞因子的分泌情况。结果荧光病毒EV71接种小胶质细胞可引起细胞形态改变,但经染细胞未观察到明显的绿色荧光;EV71接种后不同时间小胶质细胞的病毒载量未发生显著变化,但NO的合成和IL-6的表达均显著升高(48h时二者含量分别为40.9μmol/L和8 793.2pg/ml),表明小胶质细胞已被EV71激活。结论 EV71不能在小胶质细胞内进行复制,但可以激活小胶质细胞,并高表达炎症介质NO和IL-6。
- 李鹏李鹏林玮李冰清宋楠楠岳盈盈杨桂文
- 关键词：EV71小胶质细胞炎性细胞因子
- EV71济南分离株感染性克隆的构建及其生物学特征分析
- 2017年
- 目的构建以济南本土分离株为模板的EV71感染性克隆,转染细胞以获得拯救病毒并观察其生物学特性,为研究EV71病毒基因结构和功能奠定基础。方法分段扩增EV71基因组cDNA并顺序连接至pCDNA3.1载体,同时在序列两端引入自剪切核酶序列,构建能直接转染细胞的病毒基因组全长cDNA克隆,转染RD细胞后获得拯救病毒。通过噬斑形成试验、间接免疫荧光试验和感染性滴度测定观察拯救病毒的生物学特征。结果成功构建了病毒基因组全长cDNA克隆,转染RD细胞后观察到典型细胞病变,收获的病毒经RT-PCR扩增出特异性目的片段,全序列测定结果表明拯救病毒与父本株相比具有3个同义突变,未导致推导氨基酸的变异;拯救的子代病毒感染RD细胞后形成典型的空斑;间接免疫荧光试验检测拯救病毒感染细胞可见特异性荧光,荧光密度较父本株病毒稍弱;拯救病毒传代稳定,其感染性滴度(10-3.48)较父本株(10-5.0)稍低。结论成功构建了真核载体的病毒全长cDNA感染性克隆,拯救病毒与野生株具有相似的生物学性状和感染性。
- 宋楠楠岳盈盈李冰清林玮李鹏
- 关键词：肠道病毒71型全长CDNA克隆核酶
- EV71 3C蛋白酶作用靶点检测试剂盒及检测方法
- 本发明公开了一种EV71 3C蛋白酶作用靶点检测试剂盒，包括3C蛋白、多肽底物，以及酶解反应缓冲液，所述3C蛋白的序列如SEQ ID NO.1所示；所述多肽底物为Dabcyl‑EALFQGPPKFE‑Edans。本发明还...
- 李冰清孟红秦立增李鹏李志会岳盈盈宋楠楠
- 文献传递
- 鼠伤寒沙门菌ydiU基因敲除株的构建及其在压力培养条件下的生长特性研究被引量：2
- 2019年
- 目的构建鼠伤寒沙门菌ydiU基因敲除株,并比较敲除株与野生株在不同生存压力条件培养基中的生长曲线,为进一步研究ydiU基因及其编码蛋白YdiU的功能奠定基础。方法以鼠伤寒沙门菌ATCC14028株作为母本PCR扩增含有ydiU基因上下游同源臂和氯霉素抗性片段的线性打靶基因,通过同源重组操作得到ydiU基因敲除株ATCC14028AydiUo分别测定敲除株与与野生株在营养限制、氧化应激、缺铁、高盐,高糖、低PH和阿嗥等压力培养基中的生长曲线,并对两株细菌的生长特性进行比较。结果经PCR内、外侧鉴定及测序鉴定表明ydiU基因敲除株构建成功。敲除株和野生株在LB培养基中培养6 h即对数生长期后期时平均A600值分别为0.805和0.894,而在培养时间9h即平台期前期时检测平均值分别为1.022和1.220。两个生长关键期的细菌生长速度均表现为敲除株略为缓慢,但两株菌最终在平台期后期达到相同A值。在限制营养培养基(M9)中,敲除株增殖速度落后于野生株细菌,敲除株培养时间6 h、9 h和22 h的平均Ago。值分别为0.511.0.590和0.693,相同培养时间野生株平均值为0.595.0.719和0.8450以上数据表明在营养匮乏的生存压力下,ydiU基因对于细菌的生存和增殖具有关键作用。敲除株与野生株在培养基中活性氧增高、高糖、低PH、高眄|喙浓度等压力下生长速度和状态也有不同,提示ydiU基因在细菌的各种压力应激中可能发挥重要作用。结论成功构建了ydiU基因敲除株ATCC14028AydiU,其在多种压力培养基中显示出与野生株不同的生长特性,为进一步探究YdiU蛋白的功能提供了良好的基础和思路。
- 宋楠楠杜忠君岳盈盈于功昌贾强李冰清李冰清
- 关键词：鼠伤寒沙门菌
- 一种蛋白单磷酸腺苷酸化修饰检测方法
- 本发明公开了一种蛋白单磷酸腺苷酸化修饰检测方法，将SelO蛋白及底物加入到反应体系，混匀后加入1μL Bio‑17‑ATP，30‑40℃单磷酸腺苷酸化修饰反应1小时得到单磷酸腺苷酸化修饰的蛋白；将所述单磷酸腺苷酸化修饰的...
- 贾海红李冰清宋楠楠岳盈盈王玮玮李翠玲
- 文献传递
