丁谨
- 作品数：5 被引量：3H指数：1
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- HIF-2α对高原红细胞增多症模型大鼠骨髓CD71^＋细胞GATA-1表达的影响被引量：2
- 2016年
- 目的探讨低氧诱导因子-2α（HIF-2α）对高原红细胞增多症（HAPC）模型大鼠骨髓CD71^＋细胞红系特异性转录因子GATA-1表达的影响。方法选用雄性SD大鼠48只，随机分为低海拔对照组（海拔2250m饲养）和HAPC模型组（海拔4300m饲养）。在海拔4300m自然环境下复制HAPC大鼠模型并采用骨髓细胞分类计数、血液学参数和血清红细胞生成素（EPO）检测进行验证。应用密度梯度离心和免疫磁珠分选相结合的方法分选大鼠骨髓CD71^＋细胞，Q—PCR和Westernblot法检测其HIF-2α、GATA-1 mRNA和蛋白的表达。低氧培养CD71^＋细胞，以最佳干扰序列HIF-2α shRNAi3转染96h，Q—PCR和Western blot检测HIF-2α、GATA-1 mRNA和蛋白的表达水平。结果骨髓细胞分类计数、血液学参数和血清EPO含量测定结果提示HAPC大鼠模型复制成功。HAPC模型组骨髓CD71^＋细胞HIF-2α、GATA-1 mRNA和蛋白的表达高于低海拔对照组，且HIF-2α与GATA-1在mRNA和蛋白表达均呈正相关（r=0．923，P〈0．01；r=0．838，P〈0．01）。HIF-2α shRNAi3干扰HAPC模型组骨髓CD71^＋细胞96h后，HIF-2α、GATA-1 mRNA和蛋白的表达均低于空白对照组和阴性对照组。结论HIF-2α对GATA-1表达的影响可能与HAPC的发生发展相关。
- 刘芳魏巍丁谨陈英冯婷婷冀林华施继禹
- 关键词：高原红细胞增多症低氧诱导因子-2ALPHAGATA-1小干扰RNA
- 低氧下K562细胞红系分化模型的构建被引量：1
- 2018年
- 目的通过筛选更优条件,构建不同低氧(1%和3%O_2)下K562细胞红系分化模型,为后期miRNA的检测奠定基础。方法将K562细胞分别置于常氧、低氧(1%和3%O_2)条件下经不同浓度(30和40μM)氯化血红素(hemin)诱导0、48、72、96 h,以不同培养时间下的细胞浓度增长速率判断指数生长期;用联苯胺染色法选择合适的hemin浓度;结合联苯胺染色阳性细胞率、γ-globin的mRNA水平的变化以及CD235a的表达水平的变化判断细胞分化效率; MTS细胞增殖实验检测细胞增殖的情况与流式细胞周期检测结果分析细胞增殖水平的变化;用流式检测细胞凋亡率判断氧浓度对凋亡的影响。结果 (1)不同培养时间的计数结果显示48～72 h间细胞增殖速率最快。(2)联苯胺染色结果提示以40μM的hemin诱导细胞获得的阳性率更高。(3)联苯胺染色结果显示,1%O_2条件下72、96 h即刻细胞的阳性率明显高于常氧(P<0.05);而3%O_2条件下常氧低氧各时间点间无明显差异;γ-globin的检测结果显示,1%O2条件下96 h的表达水平是常氧的2.5倍(P<0.05),而同样时间、3%条件下仅为常氧的1.4倍(P<0.05);流式检测CD235a结果显示,1%O_2条件下,CD235a阳性细胞率表现为48～72 h下降,72～96 h上升的变化趋势,且96 h常氧低氧差异明显(P<0.05); 3%O_2条件下则表现为随时间延长逐步下降的趋势,96 h常氧低氧差异有统计学意义(P<0.05)。(4)结合MTS及细胞周期检测结果发现,不同氧浓度下细胞的增殖水平与常氧组无明显差异(P>0.05)。(5)流式检测细胞凋亡情况显示,1%O_2条件下72、96 h即刻凋亡率略高于常氧,但差异无统计学意义(P>0.05); 3%O_2条件下常氧低氧各时间点凋亡率差异无统计学意义(P>0.05)。结论本实验确立的实验参数,构建了符合试验要求的较为理想的K562红系分化模型(低氧下),为后期miRNA的检测奠定了基础。
- 胡彩艳刘芳付成冰丁谨张慧洁
- 关键词：低氧红系分化
- 高原红细胞增多症大鼠骨髓CD71^+细胞EpoR表达、分布变化及意义
- 2016年
- 目的观察高原红细胞增多症(HAPC)大鼠骨髓CD71+细胞促红细胞生成素受体(EpoR)表达及分布变化,并探讨其意义。方法将48只雄性SD大鼠随机分为HAPC组和对照组,每组24只。HAPC组和对照组分别在海拔4 300、2 250 m自然环境下饲养。饲养40天行血液学参数[RBC、Hb、红细胞压积(HCT)、动脉血氧饱和度(Sa O2)]和骨髓细胞分类计数检测,HAPC组RBC、Hb、HCT及红系细胞数量、中幼红细胞数量、晚幼红细胞数量均高于对照组,Sa O2低于对照组(P均<0.05),证实HAPC模型制备成功。两组均采用密度梯度离心法制备骨髓单个核细胞(MNC)悬液,CCK8法检测MNC增殖能力(以OD450表示),单层半固体培养法检测红系集落形成单位(CFU-E)数量。采用免疫磁珠分选法从两组MNC悬液中分选CD71+细胞,免疫荧光法观察细胞膜表面EpoR荧光情况,ELISA法检测细胞膜和细胞质EpoR表达,Real-time PCR法和Western blotting法检测EpoR mRNA和蛋白相对表达量。结果 HAPC组和对照组OD450分别为1.54±0.04、1.17±0.05,CFU-E数量分别为(61.25±6.84)、(12.90±4.39)个;两组比较P均<0.01。免疫荧光显微镜下可见两组细胞膜表面均有环形或半环形的绿色荧光,但HAPC组细胞膜表面EpoR荧光强度和表达EpoR荧光的细胞数量均高于对照组。HAPC组及对照组CD71+细胞膜EpoR表达分别为2.41±0.03、1.55±0.06(P<0.05);细胞质EpoR表达分别为96.39±0.42、94.49±0.65(P>0.05)。HAPC组CD71+细胞EpoR mRNA和蛋白相对表达量均高于对照组(P均<0.05)。结论 HAPC大鼠骨髓CD71+细胞EpoR表达升高,分布多集中于细胞膜表面;上述变化可能通过促进MNC及骨髓红系细胞增殖而参与HAPC的发生、发展。
- 刘芳冯婷婷冀林华韩园芳丁谨
- 关键词：高原红细胞增多症促红细胞生成素受体
- miR-210的红细胞系相关下游靶基因预测
- 2017年
- 目的利用生物信息学方法预测miR-210的红细胞系(以下简称红系)相关下游靶基因。方法利用NCBI比对分析miR-210成熟序列在各哺乳动物之间的保守性。运用基因数据库筛选miR-210的下游靶基因。采用Cytoscape中的BINGO插件对预测的miR-210下游靶基因进行GO分类富集分析。筛选参与红系增殖、分化、凋亡的miR-210下游靶基因,采用DAVID和KEGG数据库进行信号转导通路富集分析后,预测miR-210的红系相关下游靶基因。利用Targetscan在线工具验证靶基因与miR-210的相互作用关系。结果 miR-210成熟序列在多物种间具有高度保守性。筛选出416个与miR-210相关性较高的预测靶基因,其分子功能集中在蛋白结合、离子跨膜运输活动、酶结合等,参与的生物学过程集中在细胞信号转导、突触传导等,参与构成的细胞组分主要有突触小泡、细胞质、细胞器等。筛选出26个与红系增殖、分化、凋亡密切相关的miR-210下游靶基因,参与调控的信号通路主要集中于癌症信号通路、PI3K-Akt信号通路等。初步确定Smad3、Mapk10、Stat5a、Ywhag、Ctgf、Kitl6基因与红系增殖、分化密切相关,其中Smad3、Mapk10、Stat5a、Ywhag、Kitl可能受miR-210的直接调控,Ctgf可能受miR-210的间接调控。结论初步筛选出miR-210的红系相关下游靶基因Smad3、Mapk10、Stat5a、Ywhag、Ctgf、Kitl6,这些靶基因可能与红系的增殖、分化有关。
- 施继禹刘芳丁谨曹艳李文俊
- 关键词：微小RNAMIR-210红细胞系靶基因生物信息学
- 红系细胞发育相关miR-196b的靶基因预测及意义
- 2016年
- 目的预测红系细胞发育相关miR-196b的靶基因,并探讨其作用机制。方法应用miRbase数据库查找多物种已知的miR-196b成熟序列,比对后分析其在多物种间的保守性。应用miRanda、miRDB、Targetscan7.1、PITA和miRWalk数据库对miR-196b的靶基因进行预测,筛选重复率较高的靶基因。应用Cytoscape3.3.0和KEGG对重复率较高的靶基因进行GO分类富集分析和信号通路富集分析。查阅文献,再次筛选与红系细胞发育相关的靶基因,采用Targetscan7.1和RNA22分析其与miR-196b的结合情况。结果 22个物种具有miR-196b成熟序列,序列比对发现miR-196b在多物种间高度保守。靶基因预测结果显示,共得到5 004个miR-196b的靶基因,其中重复率较高的靶基因有302个。GO分类富集分析结果显示,miR-196b靶基因在生物学过程显著富集于发育过程、细胞过程和定位等,在分子功能显著富集于蛋白结合和物质转运等,在细胞组分显著富集于细胞突起和细胞器膜等(P均<0.05)。结合信号通路富集分析结果,筛选出43个与红系细胞发育相关miR-196b的靶基因,其信号通路富集于Ras信号通路、c AMP信号通路和PI3K-Akt信号通路等(P均<0.05)。结合文献,最终筛选出与红系细胞发育相关的miR-196b靶基因有5个,分别为GATA1、Cdkn1b、Pld1、Cdh1和Ntrk2,其中GATA1、Cdkn1b和Cdh1可与miR-196b直接结合。结论红系细胞发育相关miR-196b的靶基因可能为GATA1、Cdkn1b、Pld1、Cdh1和Ntrk2;miR-196b可能通过对上述靶基因的直接或间接作用激活相应信号通路,在红系细胞的发育过程中发挥生物学作用。
- 丁谨刘芳胡彩艳施继禹
- 关键词：红系细胞靶基因生物信息学
